实时荧光定量PCR具体实验步骤

实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考1样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入

0.2ml的氯仿，盖紧管盖手动剧烈振荡管体15秒后，15到3（TC孵育2到3分钟4（2下12000rpm离心15分钟离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层RNA全部被分配于水相中水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA,混匀后15到3（TC孵育10分钟后，于4C下12000rpm离心10分钟此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块

④RNA清洗移去上清液，每lmlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH20配制）,清洗RNA沉淀混匀后，4T下7000rpm离心5分钟

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40口1用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-8CTC待用2RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度

①浓度测定A260下读值为1表示40ngRNA/ml样品RNA浓度（四/ml）计算公式为A260X稀释倍数X40|Jg/mlo具体计算如下RNA溶于40|11DEPC水中，取5ul,1100稀释至495皿的TE中，测得A260=

0.21RNA浓度=

0.21X100X40|dg/ml=840pg/ml或

0.84四/口1取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35口1,剩余RNA总量为35pl X

0.84|jg/|jl=

29.4\lg

②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围L8到

2.12）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶1g琼脂糖溶于72nd水中，冷却至60℃,10ml的10X MOPS电泳缓冲液和18ml的37%甲醛溶液（

12.3M）o10XMOPS电泳缓冲液浓度成分

0.4M MOPS,pH

7.

00.1M乙酸钠

0.01M EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25Hl溶液胶凝后取下梳子，将凝胶板组织、不同发育阶段组织，或用药前后的细胞或组织等其中一种被称为实验样本，另一种就是相应地被称为参考样本实验样本和参考样本niRNA在逆转录过程中，分别用不同的红、绿荧光基团标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经过适当的洗脱步骤后，用激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3）,其比值（Cy5/Cy3）称为该基因在实验样本中的表达水平Stepl基因芯片的制备在硅胶、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上按特定的排列方式固定大量的探针，形成DNA芯片芯片种类较多，制备方法也不尽相同，基本上可以分为两大类原位合成和直接点样法Step2荧光标记探针的制备将待分析的基因探针在芯片杂交之前进行纯化、逆转录或扩增级荧光标记最普遍的荧光标记法是用Cye3-dUTP（绿色荧光）标记对照样本，Cye5-dUTP（红色荧光）标记实验室样本Step3标记探针与芯片杂交选择杂交条件，将制备的荧光探针与芯片进行杂交，一定时间以后，洗去未结合探针，然后进行荧光信号的扫描与分析Step4杂交芯片的扫描杂交后的芯片用特定波长的激光进行激发，此时芯片上的探针会发出不同波长的荧光用共聚焦激光扫描仪检测探针的荧光强度,可以得到Cy5和Cy3的两幅单色图像分别对这两幅图像进行伪色彩处理，然后叠加称为一幅图像，这就是实验所得到的原始数据一一杂交图像图像中样点的荧光强度值间接给出了基因芯片中对应探针的相对丰度值如果来自测试样本的表达丰度高，那么样点呈红色；如果来自参考细胞样本的表达丰度高，那么样点呈绿色；如果两者丰度相当，样点就呈黄色；如果二者没有进行杂交反应，则样点保持背景黑色不变通过这种方法，取自两个不同样本的基因相对表达水平差异就可以表现出来Step5将基因表达谱数据从杂交图像中提取出来，即将原始杂交图像转化为基因表达谱数据研究意义肿瘤在组织形态学上被划分为多种不同的类型和亚型，而肿瘤亚型的准确诊断对肿瘤的临床治疗具有重要意义，然而肿瘤的分型在临床上一直处于难以处理的状态，许多形态学上相似的肿瘤，如白血病的许多亚型等都会有相似的临床症状，但却需要不同的治疗方法，从分子生物学的角度上看，肿瘤是由于某些染色体上DNA损伤致使细胞内基因异常表达，导致细胞生长失控、缺乏分化和异常增生的一类复杂基因疾病正因为肿瘤发展机制的复杂性，100多年来的研究仍未揭开其中的奥秘研究肿瘤基因表达谱、选取信息基因是从信息学角度出发以寻找肿瘤相关基因、发现肿瘤基因表达特征的直接手段肿瘤基因表达谱数据显著特点是样本的位数高而样本很小、噪声冗余大而信息基因少每个样本都记录了组织细胞中所有可测基因的表达水平，但实际上只有少数基因才真正同样本类别相关，它包含了样本分类的信息信息基因选取问题是肿瘤基因表达谱分析的核心内容它既是建立有效分类模型的关键，也是发现肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的重要手段，目前人们对该问题已进行了一定程度的探索然而，如何在基因表达谱的成千上万个基因中有效选出样本的分类特征，一直是肿瘤基因表达谱分析中的难点所在，这个问题仍有待深入研究当前的肿瘤分类技术高度依赖病理学工作者对肿瘤组织的主观判断，而基于微阵列技术，即使一些组织没有显著变化，利用基因表达谱也能够对之做出早期诊断；基于基于基因表达谱的肿瘤分型和分类研究为理解肿瘤的发生的机制,以及肿瘤的临床治疗提供了重要依据；研究人员可以根据基因表达谱的变化来区分形态学上相似的肿瘤，而肿瘤类型的精确诊断将有助于制定配套的最佳治疗方案表达谱基因芯片实验操作流程

一、试剂

1.TRIzol

2.异丙醇

3.氯仿

4.75%乙醇RNase-free

5.Milli-Q水RNase-free

6.无水乙醇

7.dNTPs

8.Cy5-dCTP和Cy3-dCTP

9.杂交试剂

110.标记试剂I

11.杂交试剂

212.标记试剂n

13.反转录酶

14.标记试剂III

15.反转录引物

16.洗片试剂

117.反转录酶缓冲液

18.洗片试剂

219.DTT

20.洗片试剂3*试剂7-20为产品芯片杂交试剂盒中的组分

二、仪器与设备

1.电动玻璃匀浆机

2.电子天平

3.低温高速离心机

4.低温高速台式离心机

5.超净工作台

6.制冰机

7.电热恒温水槽

8.电泳槽

9.电泳仪

10.微波炉

11.凝胶成像仪

12.台式离心机

13.核酸定量分析仪

14.移液枪

15.可调电炉

16.旋涡混合器

17.杂交箱

18.杂交舱

19.S-200纯化柱

20.真空浓缩仪

21.盖玻片

22.芯片扫描仪

三、总RNA提取1）将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状2）将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可3）将匀浆液转移至15nli离心管中，于4℃,12000g,离心lOmin4）小心吸取上清液转入新的15ml离心管，在1530℃放置5min〜o5）向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在153（TC放置〜3mino6）于4℃,12000g,离心15min7）从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15ml离心管8）向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在153CTC放置lOmino〜9）于4℃,12000g,离心lOmin10）弃去上清，缓慢地沿管壁加入75%乙醇5ml,轻轻颠倒洗涤离心管管壁,小心弃去乙醇11）再加入75%乙醇10ml,在涡旋器上短暂涡旋；于48000g离心10mino12）小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5mino13）加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后,-8CTC保存

四、探针标记与杂交

1.预杂交1）配制预杂交液:杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀2）将配制好的预杂交液放入95T水浴锅内变性2min,将待预杂交的玻片放入95七水浴锅内变性30sec,玻片取出后即放入无水乙醇中30sec,晾干3）将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42C预杂交56hr〜

2.标记探针（以下在冰浴中进行）1）于一已灭菌的

1.5mlEppendorf管内依次加入以下试剂（反应终体积为50u1,以下试剂均为RNase-free）ddH2023u1逆转录引物5U1总RNA50lOOug〜振荡混匀，置于7（TC水浴lOmin取出后，迅速置于冰上2）分别加入以下试剂逆转录酶缓冲液10U1DTT5u1dNTPs4u13）而后在暗室中加入以下试剂逆转录酶2u1Cy5-dCTP或Cy3-dCTP3u14）用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min将Eppendorf管置于42（2水浴2hro5）依次在Eppendorf管中加入标记试剂I4口1,65（2水浴lOmin后加入标记试剂n4ulo混匀，合并对照组、实验组避光，真空抽干至50口1左右6）使用DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化DNA7）将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头8）将柱置于一个L5ml的Eppendorf管中，以3000rpm离心Imin将柱置于另一个新的L5ml Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体以3000门如离心2min,经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中9）加入标记试剂HI8u1,真空抽干

3、杂交1）在抽干的探针管中加

6.5111杂交试剂I,充分混匀，使探针溶解再加入

6.5ul杂交试剂H,混匀备用2）将预杂交的玻片取出，用ddH20冲去盖玻片3）将探针置于952水浴中变性2min；玻片置于95（2水浴中变性30sec,玻片取出浸无水乙醇30sec,探针取出后迅速置于冰上4）将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封,放入42T杂交箱内杂交过夜（1618h）o〜

4、洗片1）用

0.5%的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片2）准备两个染色缸，分别装有

0.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂

2、5%的洗片试剂3,放入6（TC水浴锅中3）将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10mino4用

0.5%的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描基因芯片技术原理及其在表达谱中的应用摘要基因芯片Gene chip,又称DNA芯片DNA chip或cDNA微矩阵cDNA Microarray,是利用光刻合成、高速打印或电定位等技术在硅、玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探针Gene probe,形成DNA微阵列样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掾入荧光标记分子与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息该技术可应用于高通量基因表达平行分析，大规模基因发现及基因分析，基因多态性分析和基因组研究等，特别在表达谱中有重大应用价值关键词基因芯片，微阵列，基因表达检测，DNA测序，人类基因组计划随着人类基因组计划的顺利进行，预计到2003年人类可以完全测出自身的基因组序列届时，人类将进入后基因组时代探明人类全部基因的结构及其表达调控将成为后基因组时代的一个重要目标，而进行基因表达的检测则是研究基因功能的一个重要环节传统的建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法，如PAGE、mRNADD和RDA等，不仅费时、费力、费钱，且不利于自动化；而DNA芯片技术结合人类基因组计划提供的大量信息，使得我们能够在全部基因组水平上对上述问题进行研究，其精细度可达到单个细胞中的一个拷贝因此有人说今后基因组研究的大部分工作将在缩微芯片实验室Laboratory ona chip完成DNA芯片是生物芯片Biochip的一种微阵列包括上万种寡核甘酸或DNA样品，密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，经电脑系统处理，分析所得资料一次微排列实验可对上千种基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测L.DNA芯片技术的基本原理DNA芯片实质上就是在芯片上按照特定的排列方式固定上大量的探针，形成一种DNA微矩阵，将样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子后，与位于芯片上的探针杂交，最后通过荧光扫描仪及计算机进行综合分析后，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息其中制备芯片的材料通常是硅片、玻片、或者是尼龙膜；探针可以是寡核甘酸或cDNA,视用途而定1-1基因芯片的制备芯片种类较多，制备方法基本上可分为两大类一类是原位合成；一种是直接点样原位合成，是指直接在芯片上用四种核甘酸合成所需的探针；而直接点样,是指将已经合成好的探针定位在芯片上1-2样品制备、杂交和检测待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法也各异为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息杂交条件的选择与研究目的有关多态性分析或者基因测序时，每个核甘酸或突变位点都必须检测出来如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核昔酸即可表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间放入电泳槽内，加足量的1XM0PS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米

②准备RNA样品取3|JgRNA,加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为lOpg/mlo加热至70℃孵育15分钟使样品变性

③电泳上样前凝胶须预电泳5min,随后将样品加入上样孔5-6V/cm电压下2h,电泳至澳酚兰指示剂进胶至少2-3cmo

④紫外透射光下观察并拍照28s和18s核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型）,上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5s核糖体RNA）组成在18s和28s核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28s核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散用数码照相机拍下电泳结果3样品cDNA合成

①反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2u12上游引物

0.2u13下游引物

0.2U14dNTP

0.1Hl5逆转录酶MMLV

0.5ul6DEPC水5ul7RNA模版2ul8总体积10ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心

②混合液在加入逆转录酶MMLV之前先7（TC干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶

0.5u1,37C水浴60分钟

③取出后立即95寸干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80（2待用4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（B-actin）实时定量PCR

①B-actin阳性模板的标准梯度制备阳性模板的浓度为1011,反应前取3Hl按10倍稀释（加水271H并充分混匀）为1010,依次稀释至

109、

108、

107、

106.

105.104,以备用

②反应体系如下标准品反应体系序号反应物剂量1SYBR Green1染料10P12阳性模板上游引物F

0.5U13阳性模板下游引物R

0.5U14dNTP

0.5ul5Taq酶1u16阳性模板DNA5ul7ddII

2032.5u18总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpni短暂离心管家基因反应体系序号反应物剂量1SYBR Green1染料10u12内参照上游引物F

0.5ul3内参照下游引物R

0.5U14dNTP

0.5nl5Taq酶1U16待测样品cDNA5ul7ddH

2032.5u18总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpni短暂离心

③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为9322分钟，然后93℃1分钟，55℃2分钟，共40个循环5制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板

①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应反应体系序号反应物剂量110X PCR缓冲液

2.5ul2MgC12溶液

1.5ul3上游引物F

0.5ul4下游引物R

0.5ul5dNTP混合液3ul6Taq聚合酶1ul7cDNA1ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpni短暂离心35个PCR循环（94（21分钟；55寸1分钟；7221分钟）；72C延伸5分钟

②PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，澳化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带

③将PCR产物进行10倍梯度稀释将PCR产物进行10倍梯度稀释设定PCR产物浓度为1X1010,依次稀释至

109、

108、

107、

106.

105.104几个浓度梯度6待测样品的待测基因实时定量PCR

①所有cDNA样品分别配置实时定量PCR反应体系体系配置如下序号反应物剂量1SYBR Green1染料10ul2上游引物lul3下游引物lul4dNTP lul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2030ul8总体积50ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心

②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应反应条件为9322分钟预变性，然后按93t1分钟，55（21分钟，72（21分钟，共40做个循环，最后7227分钟延伸7实时定量PCR使用引物列表引物设计软件Primer Premier

5.0,并遵循以下原则引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）8电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，GoldViewT”染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带实时荧光定量PCR组织RNA提取一般认为100mg肝组织提取RNA500ng,100mg肺提取RNA200ng,脑内的RNA丰度适中，lOOmg脑组织，提取RNA5-200ng所以一个10mg的海马可匀出RNA约为20ngo o反转录反应反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书反转录反应条件如下37°C15min（反转录反应）85°C5sec（反转录酶的失活反应）Real TimePCR反应选用脑源引物序列扩增片段长神经营养度因子（BDNF）为目标基因，核糖体18SrRNA（18SrRNA）做为内参基因NR2B NR2B+CCGCAGCACTATTGAGAACA213bpNR2B-ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198bprRNA+CGTTTATGGTCGGAACTACGA18s rRNA-1）按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）试剂使用量终浓度IX

12.5ul®TMzSYBR PremixEx Taq2XPCR ForwardPrimer10uM1u

10.4nMPCR ReversePrimer10u M1Ul

0.4uM模板（cDNA溶液）

0.5uldH2010LilTotal25ul全班40人，分为5组，每组做8管4管做BDNF,4管做18SrRNA04管BDNF或者18s rRNA,采用相应的正反PCR引物每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为

0.5口12）三步法PCR首先95°C作用3minPCR进行35个循环__________________________________变性秒退火秒延伸秒步骤温度时间融解曲线温度时间变温速度95°C0秒20°C/秒55°C15秒20°C/秒95°C0秒

0.1°C/秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行1将PCR反应的试管与反应板紧贴2当酶反应混合物以7（TC“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡一下，因为在

0.2-ml的PCR管中不能均匀传热4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡5对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增没有扩增产物1在提供MgC12缓冲液中，以

0.25mniol/L为梯度增加MgC12浓度；无MgC12的缓冲液以

0.5mmol/L为梯度增加MgC12浓度758295ccCooO333ooO2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA,则按上述提示浓度补加MgC12,因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度4检查模板和引物的用量5增加循环次数和/或模板DNA的用量泳道中出现模糊条带1减少循环次数或模板DNA的用量2提高退火温度，但不要超过6823重新设计引物或设计更长的引物其他值得注意的条件1建议使用

0.2-ml薄壁管厚壁管在92C时不能有效地使模板变性2最佳反应体积为50ml,推荐用30nli矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）3大多数反应中，

0.75ml（

0.51ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果〜4建议使用l.75mniol/L MgC12350mmol/L dNTP或

2.25mmol/L MgC12500mmol/LdNTP组合的混合物然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度DNA片段长度可以超过50kb,传统的基因组DNA能扩增片段至lOkbo6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA请查阅高分子量DNA提取操作过O程相关文献7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为2434个核甘酸，溶点在60%82间使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来〜增加反应的特异性这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响8变性第一步变性在94寸下进行2分钟在循环过程中尽可能缩短变性时间（94匕下进行20—30秒），除非模板中富含GC,则95C下变性30秒这可以防止DNA脱嘿琳和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12kb时，应该尽可能的降低变性温度9延伸68—72（下进行延伸操作10循环延伸尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟11长片断PCR系统扩增的片断其3;末端带有一个突出的A,因此建议采用T/A克隆若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行12测序时因酶的混合物带有3-5外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型13在无菌的

0.5ml或

0.2ml离心管中按下列操作程序加样14反应物加样顺序体积（U1）终浓度去离子水

129.410XBuffer B25IX10XPCR Buffer成分Tris-HCl pH

8.5100mMKC1500mMMgC115mM4XdNTP混合物35各200uniol/LMgC

12431.5mmol/L有义引物

52.

60.25umol/L反义引物

62.

60.25nmol/L模板

720.1ugTaqDNA聚合酶

80.4lunit

2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50口1矿物油每加一管换一次Tip

3.振荡每只管，然后短暂离心

4.将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环预变性94℃4分钟1次变性94℃1分钟退火37-65℃1分钟延伸72℃1分钟循环30次终延伸72℃7分钟1次保存4℃讨论1•假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有

①模板核酸的制备，

②引物的质量与特异性，

③酶的质量，

④PCR循环条件寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究模板

①模板中含有Taq酶抑制剂，

②在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚

③模板核酸变性不彻底在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量酶失活需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性引物引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为

①选定一个好的引物合成单位

②引物的浓度不仅要看0D值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度

③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效

④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等Mg2+浓度Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带反应体积的改变通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul,或lOOul,应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败物理原因变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率,退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率有时还有必要用标准的温度计，检测一下扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一靶序列变异如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的

2.假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高引物设计不合适选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性需重新设计引物靶序列或扩增产物的交叉污染这种污染有两种原因一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性这种假阳性可用以下方法解决

①操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外

②除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒所用离心管及样进枪头等均应一次性使用

③必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性可互相拼接,与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除

3.出现非特异性扩增带PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带非特异性条带的出现，其原因一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增其对策有

①必要时重新设计引物

②减低酶量或调换另一来源的酶

③降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数

④适当提高退火温度或采用二温度点法（931变性，65C左右退火与延伸）

4.出现片状拖带或涂抹带PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带其原因往往由于酶量过多或酶的质量差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起其对策有

①减少酶量，或调换另一来源的酶

②减少dNTP的浓度

③适当降低Mg2+浓度

④增加模板量，减少循环次数PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物PCR由变性一退火一延伸三个基本反应步骤构成

①模板DNA的变性模板DNA经加热至932左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火复性模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55七左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

③引物的延伸DNA模板一引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性一退火一延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍到达平〜〜台期Plateau所需循环次数取决于样品中模板的拷贝PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升反应最终的DNA扩增量可用Y=l+Xn计算Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平Y均每次的扩增效率，n代表循环次数平均扩增效率的理论值为100%,但在实际反应中平均效率达不到理论值反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竞争等因素大多数情况下，平台期的到来是不可避免的PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”o进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链即“长产物片段”结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用基因表达谱基因表达谱gene expressionprofile指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库，大规模cDNA测序，收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成，从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息，这样编制成的数据表就称为基因表达谱基因表达谱的获得与表示在基因芯片的实验中，首先选取来自不同状态的样本，如正常组织与肿瘤。