急性胰腺炎时腺泡细胞凋亡与Bcl-2 表达﹡_0

急性胰腺炎时腺泡细胞凋亡与Bcl-2表达*急性胰腺炎时腺泡细胞凋亡与Bcl-2表达*谢荣俊

①张树友

①李峰

①周筱筠

①刘龙飞

①卢先州

①①南华高校附属南华医院湖南衡阳421001谢荣俊*基金项目湖南省卫生厅资助项目B2007115【摘要】目的探讨急性胰腺炎AP时腺泡细胞凋亡与Bel-2表达的关系方法SD大鼠30只，随机分为假手术组A组、急性水肿性胰腺炎组B组、急性出血坏死性胰腺炎组C组采纳逆行胰胆管穿刺注射法建立急性水肿性与出血坏死性胰腺炎模型检测造模后12h各组的血清淀粉酶活性，腹水状况，胰腺组织大体、镜下病理变更与评分，腺泡细胞凋亡指数AI,Bcl-2蛋白表达状况结果DC组血清淀粉酶活性、腹水量、大体及镜下病理评分、Bcl-2阳性率显著高于B组P

0.05,腺泡细胞AI显著低于B组P

0.05o⑵B、C组中腺泡细胞AI与大体及镜下病理评分均呈显著负相关关系PV

0.05o结论Anti-TNFalpha therapyimproves survivaland amelioratesthepathophysiologic sequelaein acute pancreatitis inthe rat[J].Am JSurg,1996,1712:274-

80.

[3]Schmidt J,Rattner DW,Lewandrowski K,et al.A bettermodel ofacutepancreatitisforevaluating therapy[J].Ann Surg,1992,2151:44-

56.[4_Kaiser AM,Saluja AK,Sengupta A,et al.Relationship betweenseverity,necrosis,and apoptosisin fivemodels ofexperimentalacute pancreatitis[J].Am JPhysiol,1995,2695Pt1:C1295-

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[9]范志宁,刘训良.细胞凋亡与急性胰腺炎关系的探讨进展[J].胰腺病学，2006,63:184-

186.收稿日期2012-02-24本文编辑:陈丹云了腺泡细胞凋亡的调控【关键词】急性胰腺炎；腺泡细胞凋亡；Bcl-2Apoptosis ofAcinar Cellsand Bcl-2Expression inRats withAcutePancreatitis/XIE Rong-jun,ZHANG Shu-you,LI Feng,et al.//Medical Innovationof China,2012,911:000-000[Abstract10bjective:To explorethe relationshipbetweenapoptosis ofacinar cellsand Bcl-2expression inrats withacutepancreatitis.Methods:Thirty SDrats wererandomly dividedintothree groups:group Ashameoperation group,group Bacuteedematouspancreatitis groupand groupCacute hemorrhagicnecroticgroup.Two kindsof pancreatitismodel wereinducedby retrogradelyinjection ofsodium deoxycholate.After12hours,the serumamylase activity,ascites,apoptosis ofacinar cellsandexpression of Bcl-2were measured,the general andhistological changesof pancreaswere evaluatedby thecorrespondingscore system.Results:1The serumamylaseactivity,ascites volume,generalandhistological pathologyscore,positive rateofBcl-2in groupC weresignificantly higherthanBP

0.05,AI ofacinar cellslower thanB P

0.

05.⑵In groupB andC,AI werenegativelycorrelated withgeneral scoreand histologicalscoreP

0.

05.Conclusion Theapoptosis ofacinar cellsis aself-protection mechanismofindividuals withAP,Bcl_2is involvedwith theregulation oftheacinar cellsapoptosis.[Key words]Acute pancreatitis;Apoptosis ofacinar cell;Bcl_2First-author saddress:NanhuaAffiliated Hospitalof NanhuaUniversity,Hengyang421001,Chinadoi

10.3969/j.issn.1674-

4985.

2012.

11.000急性胰腺炎（acutepancreatitis,AP）是常见的外科急腹症，其发病机制尚未完全阐明最近发觉胰腺腺泡细胞凋亡与AP的发生、发展及转归亲密相关，使之成为当前的探讨热点Bcl-2是广受关注的凋亡相关基因，其过度激活可抑制细胞的凋亡，但目前国内外关于Bel-2与AP时腺泡细胞凋亡的探讨鲜有报道本探讨旨在深化探讨AP时腺泡细胞凋亡与Bcl-2表达的关系1材料与方法

1.1试验动物与分组SD大鼠30只（南华高校动物试验中心），雌雄不拘，体重

（28020）g,购回后适应性喂养1周抽签法随机分为假手术组（A组）、急性水肿性胰腺炎组（B组）、急性出血坏死性胰腺炎组（C组），每组10只

1.2试验试剂与器材牛磺胆酸钠（北京丰特斯化工材料有限公司）；淀粉酶测试盒（南京建成生物工程探讨所）；DNA原位末端标记凋亡检测试剂盒，Bcl-2兔抗大鼠多克隆抗体（武汉博士德生物技术有限公司）；微量泵（OLYMPUS公司）；创面封闭胶（广州香雪生物医学工程有限公司）

1.3动物模型制备对逆行胰胆管穿刺注射法加以改进术前大鼠禁食12h,自由饮水［1］2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉麻醉满足后固定于手术台，术野备皮，络合碘消毒，铺无菌孔巾取上腹部正中切口进腹显露、提取十二指肠，分辨胰胆管及肝门部胆总管顺胰胆管走行视察乳头开口位置，在其开口略偏下的对系膜缘肠壁上选取一无血管区，用5号注射器针头戳一小孔，置入预先处理过的硬膜外导管（直径

0.8mm）o导管前端贴系膜缘肠壁向乳头开口方向缓慢滑行，探入胰胆管内将导管推动5mm后，于胰胆管末端外放置一木质短棒（无菌棉签棒自制），用小圆针、1号线将胰胆管下段及其内的硬膜外导管一并缝合，确认导管通畅后打结于木棒上，同法缝扎关闭肝门部胆总管导管末端接输液转换器，用微量泵逆行泵入

0.5%（B组）或5%C组的牛磺胆酸钠

0.1ml/100g,

0.2ml/min药物泵入5min后即可见胰胆管、主胰管扩张，胰腺组织水肿、充血（见图1）,C组变更较B组严峻维持10min后剪线，移除木棒，退出导管，用创面封闭胶封闭穿刺孔将十二指肠复位，分层关腹A组进腹后仅翻动十二指肠、胰腺，不予穿刺注药三组大鼠关腹后均于大腿外侧皮下补液（生理盐水2ml/100g）,醒悟后禁食，自由饮水

1.4标本采集与观测指标术后12h再次剖腹肉眼视察胰腺大体病理变更，依据Hughes标准［2］进行评分视察腹水颜色，收集腹水并计量抽取下腔静脉血检测血清淀粉酶活性采血后切取胰腺组织，10%福尔马林固定，制作石蜡标本切片视察标本采集后断颈法处死大鼠

1.

4.1HE染色与镜下病理评分切片后行HE染色，100倍镜下视察，依据Schmidt标准［3］评分

1.

4.2DNA原位末端标记法（TUNEL法）按试剂盒说明操作，腺泡细胞胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞每张切片在400倍镜下随机选取5个视野，计算凋亡细胞数和总细胞数，凋亡指数（AI）=凋亡细胞数/总细胞数100%

1.

4.3免疫组化SABC法按试剂盒说明操作，Bcl-2染色的阳性反应为腺泡细胞的胞膜、胞浆中出现棕黄色颗粒每张切片在400倍镜下随机选取5个视野，依据阳性细胞数占视野中总细胞数的比例不同分为4级阴性阳性细胞数＜10%;轻度阳性阳性细胞数11%25%；中度阳性〜阳性细胞数26%50%；重度阳性〜阳性细胞数＞50%

1.5统计学处理运用SPSS

13.0软件进行统计分析计量资料以均数标准差（xs）表示，多组间均数比较采纳单因素方差分析，两两比较采纳LSD-t检验；等级资料多组间比较采纳Kruskal-Wallis H检验，两两比较采纳Nemenyi检验；相关性分析采纳直线相关分析P＜

0.05为差异有统计学意义2结果

2.1血清淀粉酶活性与腹水量见表lo

2.2大体病理变更及评分A组胰腺正常，腹腔内无腹水与皂化斑B组胰腺轮廓较清晰，广泛水肿，偶见点状出血，未见明显坏死，腹腔内有少中量清亮腹水，可见点状皂化斑（见图2）〜C组胰腺轮廓消逝，出血坏死严峻，可见暗黑色坏死灶，腹腔内有大量血性腹水，胰腺、胰周及肠系膜等处可见大量皂化斑（见图

3、图4）大体病理评分见表1,病变愈重，分值愈高

2.3镜下病理变更及评分A组除部分腺泡细胞水肿外，基本正常B组腺泡细胞水肿明显，无坏死，有炎症细胞浸润，间质水肿，小叶间可见炎性渗出，叶间隙略增宽，偶见微血管裂开伴红细胞溢出C组腺泡细胞肿胀明显，呈片状坏死，伴大量炎症细胞浸润，小叶结构紊乱，其间充斥着大量炎性渗出，叶间隙明显增宽，间质内微血管裂开，大量红细胞溢出镜下病理评分见表1,病变愈重，分值愈高

2.4腺泡细胞凋亡状况与AI见表1,图

5、图

62.5腺泡细胞Bcl-2的表达状况见表1,图

7、8O表1三组大鼠术后12h各观测指标比较分组血清淀粉酶U/L腹水量ml大体病理评分镜下病理评分凋亡指数%Bax阳性率%A组

1479.

10111.73*

0.

950.26*

0.

300.48*

1.

200.42*

0.

340.13*10*B组

4569.

70423.90A

6.

450.92A

3.

980.51A

10.

881.28A

3.

840.52A50A C组

7116.

90363.83#

11.

541.44#

8.

350.52#

15.

931.25#

2.

120.66#80#*A组与B组比较，P

0.05；AB组与C组比较，P

0.05；#C组与A组比较，P

0.051注药后5min,胰胆管扩张，胰腺水肿、充血图2B组术后12h胰腺轮廓较清晰，广泛水肿，局部可见皂化斑图3C组术后12h胰腺轮廓消失，出血坏死严峻，可见暗黑色坏死灶图4c组术后12h肠系膜处可见大量皂化斑图5B组TUNEL法染色见大量腺泡细胞凋亡（400倍）图6C组TUNEL法染色见少量腺泡细胞凋亡（400倍）图7B组免疫组化染色Bcl-2中度阳性（400倍）图8c组免疫组化染色Bcl-2重度阳性（400倍）

2.6腺泡细胞凋亡与胰腺病变严峻程度的相关性分析直线相关分析显示B、C组中腺泡细胞AI与大体病理评分（B组r=-

0.761,P

0.05；C组:『-

0.780,P

0.05）及镜下病理评分（B组厂-

0.763,P

0.05；C组r=-

0.664,P

0.05）均呈显著负相关关系3探讨临床上大多数AP患者病因明确（胆石或酒精因素），但为何相同的致病因素作用于不同个体时，胰腺病变的严峻程度以及临床表现和预后却不尽相同？随着分子生物学技术的发展,人们从细胞水平对AP进行了详尽的探讨[4-7],结果表明AP发生时最早的病理变更出现在胰腺的腺泡细胞内，腺泡细胞本身对损伤的反应即细胞的死亡方式（坏死或凋亡）是确定病变严峻程度以及后续病理过程发生、发展的关键假如腺泡细胞以坏死的方式死亡，将伴随猛烈的炎症反应，易产生瀑布样级联效应，使病情凶险，并向重型发展；但若以凋亡的方式死亡，则伴随的炎症反应稍微，病情向轻型发展笔者胜利建立了大鼠急性水肿性与出血坏死性胰腺炎模型，发觉B、C组在血清淀粉酶活性、腹水量、大体以及镜下病理评分等方面均存在显著差异采纳TUNEL法检测腺泡细胞的凋亡状况，发觉B组AI显著高于C组，直线相关分析发觉，两组AI与大体及镜下病理评分等反映胰腺病变严峻程度的指标均呈显著负相关关系，AI高者，胰腺病变较轻，反之则较重因此笔者认为AP时腺泡细胞的凋亡是机体的一种自我爱护机制Bcl-2作为Bcl-2家族成员［8］,主要通过变更线粒体外膜的通透性，调整促凋亡因子的释放来抑制细胞的凋亡［9］笔者通过试验发觉B组Bcl-2的阳性率显著低于C组，两组间Bcl-2的表达以及腺泡细胞AI均存在显著差异据此推想，两组大鼠在血清淀粉酶活性、腹水量、大体及镜下病理评分之间的区分可能是由于组间Bcl-2的差异性表达导致腺泡细胞的凋亡不等所致，提示Bcl-2参加了AP时腺泡细胞凋亡的调控参考文献［1］谢荣俊，张树友，费书珂，等.大鼠重症急性胰腺炎模型制备方法的探讨与改进［J］.中国医药导报，2007,ll04Z:22-

24.［2］Hughes CB,Grewal HP,Gaber LW,et al.。