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文本内容:
的影响因素Western blotting
(一)电泳是一个步骤繁多的试验很多的操作过程,每一步都会对最Western blotting终的结果产生影响,接下来的这几个帖子我想把我这段时间做Western blotting总结的一些影响试验结果的因素写下来,假如你有更好的建议,希望也能贡献出来,大家一起学习进步电泳过程是第一步,也是很重要的一步,好的电泳能让目的条带整齐,就像人工画的要做好电泳也并非易事,我总结有这些方面的因素能影响电泳效果样品质量所抽取样品的蛋白含量,蛋白变性是否充分等等,还有,蛋白样品
1.的值是否在〜之间这会干脆影响到样品浓缩的效果此外,蛋白样品PH78是否降解、目的蛋白是否已抽取充分都会对最终结果的牢靠性有影响凝胶质量不连续胶对凝胶的要求较高,详细的影响因素有
2.SDS-PAGE.分别胶的值应在左右,而浓缩胶的应在左右,最好不要1PH
8.8PH
6.8差过个单位,因为这个条件是保证电泳液中的甘氨酸不电离的必要
0.5PH PH条件,也是保证能充分压缩样品的前提因此,制备凝胶的时候所用Tris-HCl缓冲液的值是否稳定是很重要的.所用丙烯酰胺的纯度和凝胶聚合时间,PH2不纯的丙烯酰胺会含有丙烯酸,它会影响到凝胶内部局部环境,因此会影响PH电泳的效果,没有聚合充分的凝胶会含有游离的丙烯酰胺,也会影响到局部PH环境,它们还会与蛋白上的氨基、硫基以与酚羟基反应影响蛋白的泳动凝胶聚合时间以分别胶>浓缩胶>为宜此外,单体放置时间过长也45min,20min会造成丙烯酸的累积.凝胶母液混合是否匀称也会影响到凝胶浓度的分布.34配备的母液中丙烯酰胺和甲叉丙烯酰胺的比例也会影响到网孔的大小,因此也会对电泳的质量有影响,一般取特别要求的试验也可以敏捷变动30-40:1,与的加入量,极易潮解而失去活性,因此最好是现用现
5.APS TEMEDAPS配,不宜加入过多,否则会氧化蛋白样品作为加速剂,有利于氧APS TEMED自由基的富集,从而加速聚合反应,因此所用的尽量不要被氧化氧化后TEMED发黄,还有加入的也不宜过多或过少,过多会上升值并能与蛋白TEMED PH反应,过少则会造成聚合不充分,网孔变大,并且造成游离丙烯酰胺单体的增多,它们也会和蛋白反应以与变更局部.点样孔底部要平整PH6点样样品尽量不要与电泳液混合,这样能提高浓缩的效果,因为电
3.泳液值为而样品为混合后会影响到样品的值,进而影响浓缩PH
8.3,
7.5,PH效果因此,建议点样最好用长枪头,或者加样器,轻轻的将样品加到孔的底部还有,加样之前最好先冲洗一下加样孔底部,削减没有聚合的丙烯酰胺的影响还有,尽量从加样孔的中间点样,这样能使得样品在加样孔中的浓度分布尽量匀称,这也会对最终蛋白条带的形态有影响的加样量也不能过高或过低,过高会影响条带的形态,过低不利于后的杂交反应电泳缓冲液尽量用簇新配制的这样能保证值和离子强度的稳
4.PH定电压条件电压过高,一方面会使凝胶温度上升,变更凝胶内部值,甚至
5.PH会造成溶胶,另一方面,电流过大也不利于蛋白分子的分别,简单造成条带变形,电压过低,又会有样品扩散的影响我们常常用的浓缩时分别时比80V,100V较好,条带很平其他的因素,如做胶的玻璃板要干净,底下或上面不能有杂质(如铁锈等),
6.加分别胶之前要把上面的有机相洗干净,并尽量吸干水分胶板加到电泳槽之后检查胶板底部是否有气泡,有的话用枪吹走,这个会严峻影响电流方向,进而影响电泳效果
(二)转膜转膜是对最终结果影响最大的一步,砖模质量的好坏干western boltting脆确定了试验结果的好坏转膜的影响因素不多,主要有膜的选择、转印方法和试验操作三个方面首先是膜的选择问题膜的选择主要从试验目的和试验要求来考虑例如,要做分子量小于的小蛋白,的膜是不行取的,因为这样可20kD
0.45mm NC能会使得蛋白因透过膜孔而造成膜结合的目的蛋白量不确定,从而影响到最终结果的牢靠性而假如所分别的蛋白须要进行测序,则非膜不行,因为只有PVDF膜才能经受住严酷的清洗条件常用的用膜有膜、PVDF WesternNC PVDF膜和尼龙膜,它们的一些主要的特点总结如下表:尼龙膜膜膜name NCPVDF灵敏度和辨别率低较高低背景(适125-200ug/cm280-110结合实400合于存在下与蛋白SDSug/cm2ug/cm2力质的结合)软而牢机械强度高干的膜易NC材料质地无无有溶剂耐受性缓冲液润湿,避缓冲液润湿运用前甲醇润湿100%操作程开气泡序常规染色,比较于膜,NC常规染色,可用可用考马斯亮蓝染色,可放射性和非放不能用阴离子染料检测方用于检测,快速免疫ECL式射性检测检测O低浓度小分子蛋白、酸一般
0.45um蛋白性蛋白、糖蛋白和蛋白糖蛋白检测和蛋白质测序适用范多糖(主要用在核酸检围一分子
0.2um量小于测中)蛋白20kD一分子
0.lum量小于蛋7kD白价格价格较便宜便宜较贵其次是转膜方法的选择主要有半干法转膜和湿法转膜半干法操作要求高,但效率也高湿法操作要求相对低,花时间多一些最终是试验操作方面的问题运用膜的时候须要进行预处理,这PVDF里面会带来一些问题,如甲醇润湿不够,膜的有些区域不能很好的结合蛋白就会引入误差膜上面肯定不要有油脂类的东西,否则也会影响蛋白结合和抗体的杂交
(三)抗体杂交与底物显色最常用的检测方法就是用一抗和二抗的方法,其它的如用生Western blot物素-链霉亲和素或者的方法由于用的比较少,就不在此探讨了Protein G/A运用一抗和二抗的检测方法是基于信号放大的原理,加大了检测的灵敏度当然这样做也能削减成本和提高效率,我们只须要优先的几种标记的特异性好的二抗就能满意大量的试验要求抗体杂交方面能影响最终试验结果的因素不多首先是一抗的选择,尽量选择小鼠或者兔来源的单克隆抗体,还有要留意所用的抗体是否能够识别变性条件下的目标蛋白,一般说明书里标明可以用于的都是可以用来做的尽量WB Western选择小鼠或者兔来源是考虑到其他试验假如要用这种抗体的话,这两种来源的会增加适用范围单抗的特异性好,能削减非特异条带其次是一抗的杂交条件,一般用过夜为好,当然首先敬重说明书中的建议再其次就是一抗洗涤的条件,4°一般采纳含的来洗,分钟一次,洗至
0.5—l.O%oTween-20TBST535次即可,假如遇到背景比较脏的状况,也可以适当提高吐温的含量二抗一般都是效价很高的,只要室温下杂交小时就可以了,适当延长也是可以的抗体的1稀释倍数是由显色方法确定的,可以先用说明书建议的稀释条件做一下,再依据结果调整稀释倍数显影或显色这一步对结果的影响是特别大的用荧光素、同位素或者生物素标记的不常用,就不探讨了,最常用的是用标记的,常用的标记酶包括辣根过氧化物酶(属于过氧化物酶类)和碱性磷酸酶HRP HorseradishPeroxidase,POD()此外还有比较少见的葡萄糖氧化酶(AP AlkalinePhosphatase,Glucose)、半孚糖甘酶[这些酶类主要有两种检测Oxidase0L3-Galactosidase方法底物显色和化学发光辣根过氧化酶是最常见的酶促发光或显色的交联酶,由于比活高、HRP HRP特异性更强、分子量小()、稳定和作用底物范围广的优点而得到广泛运40kD用的底物种类有不少,主要可以分为化学发光底物和生色底物大类HRP2对于底物的选择,主要考虑的是灵敏度、背景和运用的便利性和稳定性的HRP生色底物显色有和等(而得到可溶性产DAB,4-CN,CN/DAB,AEC TMB物的底物如等则适用于)中这几种显色底物的各种性能OPD,ABTS ELISA的比较见下表:DAB4-C AECTMBN3,3-diaminobenz3-amino-9-e3,3,5,54-chloro-l-nap名idine htholathyl tetram ethylbtetrahydrochloride
210.
28240.4分
214.
14178.58enz子carbazol idine是好一般避光好定性灵250Pg InglOOpg敏度背一般低景终不能很好的成像简单成像简单成像产物成像性颜褐色介于蓝色与蓝紫棕红色蓝紫色色色之间(可用于double-staining)商有(疑有治癌作用)无有无性化学发光反应底物可以用琳琅满目来形容常见的化学发光底物包括HRP、(原安玛西亚)的系歹!还有公Luminol GEHealthcare ECLJ,Pierce司的系列等系列是经典的化学发光底物,但现SuperSignal LuminolHRP在发展出来的高效的化学发光底物更受欢迎在很多探讨人员心目中的几乎ECL成为化学发光法的代名词,有时竟然是高品质文章的保证之一,可见其经典GE公司后来推出的和不单将检测灵敏度Healthcare ECLPlus ECLAdvance提高了倍,发光时间也长达小时以上公司的10—2024Pierce灵敏度高(有级,级,SuperSignal10-12g10-14g级选择),发光长久(小时),可反复曝光,稳定性好(室温贮10-15g6-24藏个月,至少是个月),节约抗体64C12有一点须要留意的是二抗最好不用叠氮化钠做防腐剂,因为叠氮化钠是HRP的抑制剂。