《污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查 RT-PCR法》

ICS

07.080CCS B40T/GXAS体标准T/GXAS XXXX-XXXX污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查法RT-PCRDetect i on off porei nebIue eard isease v i rusi nwastewater—RT-PCR（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施广西标准化协会发布污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查法RT-PCR范围1本文件描述了污水中猪蓝耳病病毒快速筛查的方法本文件适用于污水中猪蓝耳病病毒的快速筛查规范性引用文件2下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件分析实验室用水规格和试验方法GB/T6682术语和定义3下列术语和定义适用于本文件

3.1猪蓝耳病porei neb Iue eard isease猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪传染病，主要病症表现为母猪流产、仔猪发病死亡和不同年龄猪呼吸障碍等

3.2富集浓缩试齐|J enri chmentand concentrati onreagent采用聚乙二醇（PEG）离心沉淀法，用于对大体积生活污水或其他水体样本中病原体的核酸片段进行浓缩富集使用本试剂盒提取的病毒可适用于各种常规操作，包括和DNA/RNA PCR,RT-PCR,qPCR qRT-PCR等实验

3.3病毒富集浓缩virus enri chmentand concentration将污水样品混合均匀，经离心并弃除离心管中的上清液,将磷酸盐缓冲液加入至离心管中，反复吹吸沉淀，最终形成污水病毒的混悬液（该水样的浓缩液）

3.4目舜时水样instantaneous watersamp Ie采样点位某一时间随机采集的样本

3.5混合水样mixed watersamp Ie同一采样点位不同时间所采集的瞬时水样混合后的样本

3.6Ct值cycle threshoId在实时荧光定量中，每个反应体系中的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数PCR原理4向污水中加入富集浓缩试剂，富集浓缩试剂可使病毒颗粒形成多聚体，通过离心作用将水溶液与病毒颗粒多聚体分开，收集病毒颗粒多聚体形成的沉淀，采用核酸提取和实时荧光检测RT-PCR试剂和材料5除另有说明外，所用试剂均为分析纯，分子生物学试剂所用水为规定的一级水GB/T6682磷酸盐缓冲液值

1.11mol/L PBS,pH

7.2富集浓缩试剂

1.2病毒核酸提取试剂盒

1.3无核酸酶水分子生物学级

1.4离心管，、

5.

51.5mL50mL

5.1无菌移液器吸头、、带滤芯，无核酸酶10uL200uL1mL,

5.2无菌聚乙烯瓶

5.3透明薄壁管PCR

0.2mL仪器设备6冰箱（）

6.10℃~20℃

6.1电子天平精度

0.01g

6.2高速台式冷冻离心机可控温至-离心速度4℃,213000g

6.3低速离心机离心速度12000r/min

6.4金属水浴锅

6.5振荡混匀器

6.6高压灭菌器

6.7实时荧光扩增仪PCR

6.8二级生物安全柜样品采集及前处理

76.9样采集、运送和保存据采样场所排水系统分布情况，重点选取污水排水口、内部管网汇集处等关键位置，对未经消

6.

9.1杀处的污水进行采样据现场条件和检测需求确定水样采集方式，如瞬时水样或混合水样

6.

9.2无菌聚乙烯瓶采集污水样本，采样体积为

6.

9.3200mL〜300mL本采集后，应在现场使用酒精对采样瓶外表面进行消毒，并及时将样本送至实验室，运输

6.

9.475%过程中水样温度保持在0℃〜4℃o验室接到水样后应尽快进行检测，如未及时检测，应将水样置于冰箱保存待检

6.

9.5-4C

6.10毒富集浓缩将污水样品混合均匀，取同一厂各管的污水分别置于个离心管中，在-、

7.

2.13401nL350nli4℃2500r/min的条件下离心剩余污水样本作为备份30min将中所得上清液分别转移至试剂盒提供的预混试剂离心管中，充分混合，震荡摇匀在

7.2,

27.

2.130min、的条件下离心离心机降速时不应使用制动力将离心管从离心机上取出，倾倒-4℃12000r/min120min,并弃除离心管中的上清液，至无上清液倒出注该过程需减少沉淀的溶解与损失，以提高病毒浓缩富集效率在、的条件下离心离心机降速时不应使用制动力将离心管从离心机上取下，

7.

2.4-4℃12000r/min5min,用移液器从每个离心管中吸出剩余的上清液注请勿将吸管尖端接触沉淀

7.

2.5将200皿磷酸盐缓冲液（

5.1）加入至离心管中，反复吹吸沉淀，最终形成混悬液（该水样的浓缩液），同一厂管污水悬混液合为管浓缩液31将浓缩液转移至离心管中，于条件下保存,并于内完成核酸提取和扩增

7.

2.

61.5mL0℃〜4C24h实时荧光RT-PCR检测

8.

8.1核酸提取在二级生物安全柜中打开装有污水样本浓缩液的离心管，按照病毒核酸提取试剂盒说明，取适量浓缩液进行核酸提取，提取完成后应立即封盖并进行实时荧光检测剩余的浓缩液和核酸样本应于RT-PCR-4℃条件下冻存

8.2核酸扩增参照猪繁殖与呼吸系统综合征（蓝耳病）荧光检测试剂盒说明书进行每个样本设置个平行PCR3结果评价9阳性结果评价

9.1阳性对照通道与通道值均且出现特异性扩增曲线阴性对照应无值，且无特

9.

1.1FAM VICCt V35Ct昇性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验通道值＜且出现特异性扩增曲线，判定为病毒核酸阳性

9.

1.2FAM Ct38通道值判定为可疑，应对样本进行复测，若复测结果值仍在之间有明

9.

1.3FAM Ct38VCtW45,Ct38〜45显指数增长，则判定为阳性，否则为阴性阴性结果评价

9.2通道无值或无典型型扩增曲线，同时通道值判为阴性，表明样品中未检出病毒

9.

2.1Ct S-VIC CTV38,核酸通道无值或无典型型扩增曲线，同时通道值＞或无值，则该样本检测结果

9.

2.2FAM CtS VICCT38CT无效，应重新安排采样检测检出限10猪蓝耳病病毒的方法检出限为1copies/mLo。