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附件5那西肽残留检测方法标准试行鸡可食性组织中那西肽残留量的测定高效液相色谱法试行1范围本方法规定了鸡可食性组织中那西肽的制样和高效液相色谱测定方法本方法适用于鸡的肌肉、肝脏、肾脏和皮+脂肪中那西肽残留量的检测2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款其中,注口期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本包括所有的修改单适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3原理试样中残留的那西肽用乙月青提取,正己烷脱脂,高效液相色谱-荧光检测器测定,外标法定量4试剂除另有规定外,所有试剂均为分析纯,水为符合GB“6682规定的一级水
4.1试剂和材料
4.
1.1乙情CHjCN色谱纯
4.
1.2甲醇CH OH色谱纯
34.
1.3N,N—二甲基甲酰胺HCON CH32:色谱纯
4.
1.4磷酸H3Po
44.
1.5正己烷C HO
6144.2溶液配制磷酸溶液量取磷酸
0.25mL加水至1000mL,摇匀,即得
4.3标准品那西肽Nosiheptide,C51H43N13O12S6,CAS号:56377-79-8含量*
8.0%,或相当者
4.4标准溶液制备
4.
4.1标准储备液精密称取那西肽标准品约25mg,于25mL量瓶中,用N,N-二甲基甲酰胺溶解并稀释至刻度,配成浓度为1mg/mL的标准储备液-20℃保存,有效期6个月
4.
4.2标准工作液准确量取1mg/mL标准储备液
0.1mL,于100mL量瓶中,用甲醇稀释定容至刻度,配置成浓度为1pg/mL的标准工作液-20C保存,有效期3个月.
4.5材料有机微孔滤膜
0.225仪器和设备
5.1高效液相色谱仪配有荧光检测器FLD
5.2分析天平感量
0.00001g和
0.01g
5.3氮吹仪
5.4旋涡混合器3000转/分钟
5.5匀浆机
5.6离心机3000转/分钟
5.7振荡器
5.8的制备与保存
6.1试料的制备取适量新鲜或解冻的空白或供试组织,绞碎,并使均质——取均质后的供试样品,作为供试试料——取均质后的空白样品,作为空白试料——取均质后的空白样品,添加适宜浓度的标准溶液,作为空白添加试料
6.2试料的保存-20℃以下保存7测定步骤
7.1提取称取(2±
0.05)g试料于50mL离心管中,加入10mL乙腊,并加入陶瓷均质子,涡旋混匀,振荡提取10分钟;于5000转/分钟离心5分钟,倾出上清液至另一个50mL离心管中,剩余残渣用10mL乙牌重复提取一次,合并两次提取上清液,加入20mL正己烷,涡旋1分钟,5000转/分钟离心5分钟,弃去上层正己烷层,取下层液体40C下氮吹至干;准确加入
1.0mL甲醇涡旋混匀1分钟,过滤膜后供高效液相色谱仪测定
7.2标准曲线的制备分别精密录取标准工作液,用甲醇稀释成浓度为
0.
01、
0.
02、
0.
04、().
1、
0.2pg/mL的标准溶液,供高效液相色谱仪测定临用前配制以测得的峰面积为纵坐标,对应的标准溶液浓度为横坐标,绘制标准曲线求回归方程和相关系数
7.3液相色谱参考条件a)色谱柱:C18柱(250mmx
4.6mm,5pm),或相当者;b)柱温30°C;c)进样量20pL;d)流速l.OmL/min e)荧光检测器激发波长327nm,发射波长521nm;f)流动相磷酸溶液和乙盾,梯度洗脱程序见表1表1流动相梯度洗脱条件时间磷酸溶液乙胞min%%
05248852488.
1010012010012.
152481752487.4定性测定试样溶液色谱图的保留时间在标准溶液的保留时间偏差的±
2.5%之内
7.5定量测定取试样溶液和相应浓度的标准溶液,作单点或多点校准,按外标法以峰面积计算标准溶液及试样溶液中那西肽响应值均应在仪器检测的线性范围之内在卜.述色谱条件下,标准溶液、空白试样溶液和空白添加试样溶液色谱图见附录A中图A1〜图A
37.6空白试验取空白试料,除不加标准溶液外,采用完全相同的测定步骤进行平行操作8结果计算与表述单点校准,试料中那西肽残留量按下式计算CsXAXVX=-AsXm或标准曲线校准由标准曲线方程4二a C+b,求得a和b,则「A-bc=a按下式计算那西肽的残留量CXVx=m式中X一试样中相应的那西肽残留量,单位为微克每千克(Rg/kg);C——标准溶液中相应的那西肽浓度,单位为微克每升(腐/L);sC—试样溶液中那西肽浓度,单位为微克每升Rg/L);A——试样溶液中相应的那西肽的色谱峰面积;A.,一标准溶液中相应的那西肽色谱峰面积V—溶解残余物所用的溶液体积,单位为亳升(mL);ni-----试样质量,单位为克(g)o注计算结果需扣除空白值测定结果用两次平行测定的算术平均值表示,保留三位有效数字9方法灵敏度、准确度和精密度
9.1灵敏度本方法的检测限为5|ig/kg,本方法的定量限为1Opg/kgo
9.2准确度本方法在1(诞/kg〜60pg/kg添加浓度水平上的回收率为60%〜120%
9.3精密度本方法批内相对标准偏差W15%,批间相对标准偏差W20%附录A资料性附录色谱图图A1那西肽标准溶液色谱图
0.02pg/mL图A2鸡肝脏组织空白试样色谱图图A3鸡肝脏组织空白添加那西肽试样色谱图(lOpg/kg)。