含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定BJS201915

含乳饮料及其乳原料中酪蛋白含量的测定BJS201915范围1-本方法规定了含乳饮料及其原料中酪蛋白四种亚型酪蛋白、-酪蛋白、酪蛋白、K酪蛋白asi-as2B-含量测定的方法本标准适用于含乳饮料及其原料中酪蛋白总含量的测定，不适用于发酵法、酶解法、水解法等工艺对蛋白质改性的样品原理2试样溶液中的酪蛋白采用等电点沉淀后复溶，用胰蛋白酶进行酶解，同时加入同位素内标，水C18相柱分离，采用液相色谱-串联质谱仪检测，内标法定量试剂和材料3除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为规定的一级水GB/T6682试剂

3.1浓盐酸

3.

1.1HC

13.

1.2甲酸CH O质谱级

223.

1.3醋酸CHCOOH色谱级3孝典善膏白=CMt熨x flx f2x f3式中:错误!未找到引用源一（步骤

5.1中）50mL试样溶解液中各酪蛋白亚型的蛋白浓度aSl-、、单位为aS2-[3-K-,pmol/L;错误!未找到引用源一经标准曲线计算后各酪蛋白亚型的肽段浓度，即代表各酪蛋白亚型蛋白浓度，单位为|imol/L；错误!未找到引用源—（步骤

5.5中）试样酶解后的定容体积，单位为mL（1mL）；错误!未找到引用源—（步骤

5.5中）试样稀释液的酶解体积，单位为mL（

0.2mL）；错误!未找到引用源（10mL）；（步骤中）从溶解的试样中抽取用于

5.1（步骤中）复溶试样中沉淀蛋白的溶液体积，单位为

5.2mL沉淀蛋白的溶解液体积，单位为mL（10mL）；错误!未找到引用源—（步骤

5.3中）Bradford或BCA法测定后，稀释复溶蛋白溶液的稀释因子试样溶液中各酪蛋白亚型的含量计算

6.2试样中各酪蛋白亚型的含量按式

（2）计算错误!未找到引用源（）Xi=2式中Xi—试样中各酪蛋白亚型的含量aSl-、aS2-、供、K-,单位为g/100g或g/100mL；错误!未找到引用源一（公式中）试样溶解液中的各酪蛋白亚型浓度、、-、单1aSl-aS2-K-,位为|imol/L;-

一、K酪蛋白的相对分子量（附录表）单位为M aSl-aS2-0-A A.2,g/mol;错误!未找到引用源一溶解样品的溶液体积，单位为mL（50mL）；一试样质量或体积，单位为或者m gmL注试样中各酪蛋白亚型的含量需按照附录表中的蛋白分子量计算A A.2计算结果以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留两位有效数字总酪蛋白含量计算

6.3试样中酪蛋白总含量按式

（3）计算错误!未找到引用源⑶A=—试样中各种酪蛋白亚型含量的总和，即试样中酪蛋白的总含量，单位为或A g/100gg/100mL；错误!未找到引用源一试样中aSl-型酪蛋白的含量，单位为g/100g或g/100mL；错误!未找到引用源一试样中aS2-型酪蛋白的含量，单位为g/100g或g/100mL；错误!未找到引用源一试样中供型酪蛋白的含量，单位为g/100g或g/100mL；错误!未找到引用源一试样中型酪蛋白的含量，单位为或K-g/100g g/100mL7精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%o其他8本方法的特征肽段、粉状及液体含乳饮料、粉状及液体乳原料的检出限与定量限如下表所示:4表仪器、方法检出限及定量限4特征肽段仪器LOD/LOQ型酪蛋白一型酪蛋白.型酪蛋白asi-as2K型酪蛋白p-nmol/Lnmol/L nmol/L nmol/L检出限LOD1111定量限LOQ3333粉末状含乳饮料方法LOD/LOQ（以试样称取，溶液定容计算）5g50mLasi-型酪蛋白（XS2-型酪蛋白P-型酪蛋白K-型酪蛋白胆%/g Ng/g gHg/g检出限LOD

0.

250.

260.

250.21定量限LOQ

0.

740.

780.

750.64液体状含乳饮料方法LOD/LOQ（以试样量取，溶液定容计算）10mL50mLasi-型酪蛋白as2-型酪蛋白B-型酪蛋白K-型酪蛋白gg/mL gg/mL pg/mL|ig/mL检出限LOD

0.

120.

130.

130.11定量限LOQ

0.

370.

390.

380.32粉末状乳原料方法LOD/LOQ（以试样称取，溶液定容计算）1g50mLas「型酪蛋白as-型酪蛋白佚型酪蛋白K-型酪蛋白Ftg/g咽g四g/g咽g检出限LOD

1.

21.

31.

31.1定量限LOQ

3.

73.

93.

83.2液体乳原料方法LOD/LOQ（以试样量取，溶液定容计算）2mL50mLas「型酪蛋白as-型酪蛋白B-型酪蛋白K-型酪蛋白四g/mL gg/mL|ig/mL|ig/mL检出限LOD

0.

610.

650.

630.53定量限LOQ

1.

82.

01.

91.6本方法的准确度如下表所示:5酪蛋白加标水平（）回收率（％）精密度（％）gmol/L

0.

0171.

07.

70.

0571.

65.

50.

164.

34.

50.

570.

75.

2264.

75.

9556.

65.8附录A表酪蛋白肽段标准品信息A.1相对分子量Mw序号名称肽段序列（）g/mol酪蛋白1asi-YLGYLEQLLR

1267.5酪蛋白（内标）与小2asi-PSERYLGYL*EQLLRLKKY

2276.6-酪蛋白3as2FALPQYLK

979.2酪蛋白（内标）不4as-RY0KFALP0YL*KTVY

02053.3供酪蛋白5VLPVPQK

780.06性酪蛋白（内标）SOSKVL乜，」N PVPQKAVPY

1648.0酪蛋白7K-YIPIQYVLSR

1251.5酪蛋白（内标）乜，伏8K-KIAKYIPIQYVL*SRYPSY

2209.6表酪蛋白各亚型蛋白相关信息表A.2相对分了里Mw即Dalton亚型代码氨基酸数目Uniprot g/mol酪蛋白asi P02662CASA1_BOVIN21424529酪蛋白as2P02663CASA2_BOVIN22226019酪蛋白B P02666CASB_BOVIN22425107酪蛋白K P02668CASK_BOVIN19021269注以上酪蛋白各亚型的分子量来源于UniProt数据库（）,可通蛋白数据库代码在网站上查询酪蛋白相关参数附录B酪蛋白检测流程示意图称取1・独固体样品或者液体样丛10mL揄入10ml加入到惟影水调附体60T.2,8€NK1瓶中后用系的浴冷pH FiifkaM——lh.取1u高心30mLTns-却后定在10OOO r/mm10mL-1t溶解HCI溶液溶容至

4.1*15min»弃去上清液涡货液.收集沉淀蛋白解之间50mL混勾步骤试样正白提取

5.1称・为检氏lU051g*4或者・班体孔l2ml.样品中沉淀步骤成样总蛋白含■测定及的素白步骤，试样软溶2成样的稀料11k舄心I0000r/mm向上述沉港“60c Bradford淀中加入Ihnnit保曲F5P5n*若样品中g赤白水浴・液，，.夏溶量自沉出一^师的浓度不在Tris-HCI理明上E41“A”定急击fl30mm淀重安提取一之溶液SmL含吊

0.2〜,7mg EL次.靖合间,则需要稀蜂到先后共两次总体此范根内用记业口品枳为稀将倍数IdmLV曼溶体复溶的蛋臼幡林液步骤试样的曲解S.5（已知总蛋白浓度）按370c.16h在新L5mL再分别加入加长内标权应40|iL w/w=120IWl的管中加EP■loooo cr混标—计算一工作液（浓度均为加脚鼠.X i入浓炭为一『禹心，

2.5jimoLL并且定容—*r mifiK-|~»20pL）

0.2M.7ing/5-IOmmt.1mL之间的mL号2取上清液甲审溶液分析-10%义溶策臼溶样品液2005定咨体祖V常定浓度c校正胰蛋白瞬漏切附录c酪蛋白标准溶液的多反应监测色谱图制量白5YLGYLEQI4R明姐*台FALPQYLK0・春白ncffiVLPVPQK图酪蛋白标准溶液的多反应监测色谱图D.15jimol/L工■量白YIHQYVl^R本方法负责起草单位中国食品药品检定研究院验证单位浙江省食品药品检验研究院、上海市食品药品检验所、绿城农科检测技术有限公司、大连出入境检验检疫局检验检疫技术中心、酒泉市食品检验检测中心主要起草人孙姗姗、刘柱、李晓雯、郝星凯、张晓林、李婷婷氯化钠

1.

1.4NaCl

1.

1.5乙月青CHCN质谱级3三羟甲基氨基甲烷

1.

1.6Tris,C HnNOo43聚乙二醇辛基苯基醴

1.

1.7Triton X-100,C34H

1.

1.8胰蛋白酶Trypsin,C6Hl5O12P3质谱级，猪源、牛源、基因工程来源均可；建议采用基因工程级的胰蛋白酶以降低杂酶的影响试剂配制

3.

23.

2.1盐酸溶液6mol/L吸取25mL浓盐酸，用水稀释并定容至50mL

3.

2.2甲酸溶液10%V/V吸取1mL甲酸，用水稀释并定容至10mL

3.

2.3醋酸溶液

0.3%V/V吸取

0.3mL醋酸，用水稀释并定容至100mL324氯化钠溶液

0.5mol/L,含

0.2%Triton-X100称取

14.625g,加200mL水溶解后,加入1mL Triton混匀溶解后，用水定容至X-

1003.

1.7,500mL

3.

2.5Tris-HCl溶液50mmol/L称取

6.057gTris,加900mL水溶解,用6mol/L盐酸溶液调pH至

8.5后，用水定容至经微孔滤膜过滤，备用1000mL,

0.45pim胰蛋白酶液用醋酸溶液将胰蛋白酶粉末溶解至后，按照单次使用量进行稀释分

3.

2.

63.

2.3Img/mL装，如每瓶错误味找到引用源或错误味找到引用源的胰蛋白酶,冷冻50L100L

0.2mg/mL-8TC保存，避免反复冻融蛋白质浓度测定试剂盒基于考马斯亮蓝测定法或蛋白质测定法均可

3.

2.7-Bradford BCA

3.

2.8甲酸水溶液（

0.1%V/V）吸取

0.5mL甲酸，用水稀释并定容至500mL标准品

3.3酪蛋白特征肽标准品纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质3313-YLGYLEQLLR,-酪蛋白特征肽标准品纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质

3.

3.2as2FALPQYLK,酪蛋白特征肽标准品纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质3330-VLPVPQK,-酪蛋白特征肽标准品纯度须准确标定，或经国家认证的标准物质334K YIPIQYVLSR,

3.

3.5酪蛋白特征肽内标标准品（心级纯度asi-PSERYLGYL*N EQLLRLKKY.HPLC N98%

3.

3.6酪蛋白特征肽内标标准品（乜，皈）级纯度as2-RYOKFALPOYL*KTVYO,HPLC N98%

3.

3.7））酪蛋白特征肽内标标准品（N级纯度0-SOSKVL i3c$,PVPQKAVPY.HPLC N98%

3.

3.8-15）K酪蛋白特征肽内标标准品（於（N级纯度KIAKYIPIOYVL*2§,SRYPSY.HPLC N98%L*（13C,15N）同位素标记亮氨酸，以上标准品的相对分子量见附录A表Al6标准溶液配制

3.

43.

4.1标准储备溶液（400|imol/L）根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型（）称样量，精确称取适量（精确至）标准品后，用溶液（）溶解,定

3.

3.1-

3.

3.

40.01mg Tris-HCl

3.

2.5容于10mL容量瓶中，各酪蛋白亚型特征肽（331-334）浓度均为400|imol/L,此溶液密封后-20错误!未找到引用源冷冻保存，有效期个月

33.

4.2混合标准溶液准确吸取各酪蛋白亚型特征肽标准储备液

（341）1mL至100mL容量瓶中,加入Tris-HCl溶液

（325）稀释至刻度，得到各酪蛋白亚型特征肽浓度为4|imol/L的混合标准溶液，此溶液密封后错误!未找到引用源冷冻保存，有效期个月-201混合标准工作溶液准确吸取混合标准溶液用纯水稀释，配制成浓度依次为

3.

4.

33.

4.2,

0.02imol/L

0.1的系列混合标准工作液，错误!未找到引用源冷冻保|imol/L

0.2|imol/L

1.0|imol/L211moi/L-20存，有效期周

13.

4.4内标标准储备溶液10pmol/L根据标准品纯度及肽段标准品相对分子量计算不同酪蛋白亚型称样量，精确称取适量精确至内标标准品后，用溶液溶解，配制成

33.5-

3.

3.

80.01mg Tris-HCl

3.

2.5各酪蛋白亚型特征肽浓度均为的内标标准储备溶液，此溶液密封后错误!未找到335-33810|imol/L-20引用源冷冻保存，有效期个月3内标混合标准溶液准确分别吸取各酪蛋白亚型特征肽内标标准储备溶液混合，

3.

4.

50.25mL

3.

4.4配制成浓度为内标混合标准溶液错误!未找到引用源冷冻保存，有效期个月

2.5pmol/L1mL,-201混合标准品酶解溶液分别准确吸取各系列混合标准工作溶液到低吸附聚丙

3.

4.65001L

3.

4.32mL烯离心管中，向每个浓度中加入内标混合标准溶液再加入的.的胰蛋白PP401L345,5|iL2mg/mL酶液含胰蛋白酶，用纯水定容至后充分涡旋，在错误!未找到引用源3261pig1mL1000r/min,4条件下，离心盖紧瓶盖，在错误!未找到引用源水浴或者恒温箱内孵育后，取出1min3715-16h加入的甲酸溶液终止酶解反应混匀后，在错误!未找到引用源条件下20|iL10%

3.

2.210000r/min,4离心静置，取上清液备用上清液在错误!未找到引用源冷冻保存放置天内稳定10min,-204-5材料

3.5低吸附型、、聚丙烯离心管

3.

5.12mL15mL50mL PP低吸附型聚丙烯（）枪头

3.

5.2PP

3.

5.3低吸附型聚苯乙烯（PS）96孔板（用于总蛋白含量测定）仪器和设备4高效液相色谱-串联质谱仪配有电喷雾离子源

4.1酶标仪

4.2分析天平感量分别为、和

4.

30.001g

0.0001g

0.00001g低温离心机转速

4.4N6000r/mino恒温水浴锅或可控温培养箱

4.5计

4.6pH涡旋振荡器

4.7分析步骤5试样蛋白提取

5.1含乳饮料固体试样（若含乳包装为独立包装，应与其他调味粉末混合后取样，例如咖啡、奶茶等饮品）试样称取（精确至）于锥形瓶中；若为乳饮料液体试样精密量取试样1g〜5g

0.001g10mL于锥形瓶中，加入30mL预温（40错误!未找到引用源）的Tris-HCl溶液

（325）,混匀后,放入60错误!未找到引用源水浴恒温振荡1h,取出冷却后用Tris-HCl溶液

（325）转移定容至50mL容量瓶（V溶解体枳）乳粉原料粉试样称取试样（精确至）于锥形瓶中；若为液体乳试样精密量

0.5g〜1g

0.001g取试样1〜2mL于锥形瓶中，加入30mL预温（40错误!未找到引用源）的Tris-HCl溶液

（325）,混匀后，放入错误!未找到引用源水浴恒温振荡取出冷却后用溶液（）转移定容至601h,Tris-HCl

3.

2.550mL容量瓶（V溶解体积）精密量取（上述完全溶解的试样溶液（视检无明显结块），按体积比（）加入10mL Vv/v=l:l沉淀体积）10mL氯化钠溶液

（324）,涡旋振荡混匀后，用10%甲酸溶液

（322）调节试样的pH值到

4.6〜

4.8之间，错误!未找到引用源条件下静置过夜，待所有蛋白沉淀析出已析出的沉淀试样在2-810000r/min,错误!未找到引用源条件下离心弃去上清液，沉淀以备复溶415min,试样复溶

5.2向上述沉淀试样（

5.1）中加入5mLTris-H溶液

（325）,涡旋振荡5〜10min,使溶液充分溶解，放入错误!未找到引用源水浴恒温振荡取出后继续混匀（视检无明显结块）试样溶液在6030min,10错误!未找到引用源条件下离心弃去沉淀，留取上清液上述步骤重复次，合并000r/min,415min,1两次复溶的上清液后，可用溶液（）定容至（Tris-HCl

3.

2.510mL V复溶体积）试样总蛋白的含量测定

5.3按照或法试剂盒所述方法测定复溶试样溶液（）中总蛋白质的含量（单位）Bradford BCA

5.2mg/mLo试样的稀释

5.4为保证该实验在最佳的酶解效率下进行，需根据试样中总蛋白的含量测定结果（

5.3）,用Tris-HCl溶液（

3.

2.5）对复溶后的试样溶液进行稀释（f3，使试样稀释液中的总蛋白含量保持在

0.2mg/mL稀释倍数）之间〜

0.7mg/mL试样的酶解

5.5该实验的最佳酶解效率为酶的质量/总蛋白质量根据此原则推算，若试样稀释液中总蛋白=1:20,含量在

0.2mg/mL〜

0.7mg/mL之间，按取样量200HL进行酶解（V则其对应的总蛋白质质量范函解体积），围在朗之间，加入胰蛋白酶的量则在席范围内40〜140/g2〜7|ig取200^iL（丫酶解体积）稀释后的试样（

5.4）,按照上述计算依据，加入适量胰蛋白酶液

（326）,向试样中加入40|1L内标混合标准溶液（

3.

4.5）,用纯水定容至1mL（V后充分涡旋，在1000r/min,定容体积）错误!未找到引用源条件下，离心盖紧瓶盖，在错误!未找到引用源水浴或者恒温箱内41min37孵育后，取出加入的甲酸溶液（）终止酶解反应混匀后，在错15-16h20pL10%

3.

2.210000r/min,4误!未找到引用源条件下离心静置，上清液以备分析10min,注当回收率达不到本标准要求时，应考虑对蛋白酶活力进行评价可以选用市售标准蛋白质质控样品（标明准确蛋白含量且已知目标肽段分子量的产品）随行酶解步骤，检测评估及控制仪器参考条件

5.6液相色谱参考条件

5.

6.1a）色谱柱Ci8亲水柱（T3）,柱长100mm,内径

2.1mm,粒径

1.8|im,填料孔径错误!未找到引用A源IOO或性能相当者；）流动相流动相为甲酸.水溶液（）流动相为乙晴（）参考梯度洗脱程序b A

0.1%

3.

2.8,B

3.

1.5,见表1;c）流速.3mL/min；）柱温错误!未找到引用源；d30e）进样量5|1L；表参考梯度洗脱程序1时间minA

0.1%甲酸-水溶液％B乙月青%

09550.

59554.

550504.

635654.

735654.

89559.1955质谱参考条件离子源电喷雾离子源；a扫描方式正离子扫描；b监测方式多反应监测模式，酪蛋白母离子、子离子和碰撞能量见表c2d毛细管电压3500V；e锥孔电压10V；离子源温度错误!未找到引用源;f150g偏转电压50V；h锥孔气流量150L/h；脱溶剂气温度错误!未找到引用源；i500j脱溶剂气流速800L/h；表酪蛋白各亚型特征肽的主要质谱参数2母离子子离子碎裂电压碰撞能量序号化合物m/z m/z VeV991*4521酪蛋白特征肽1asi-

634.52494528酪蛋白特征肽asi-998*45212638（内标）2494528648*4015酪蛋白特征肽3as2-

490.52264030as2-酪蛋白特征肽655*40154494（内标）2194018568*3011酪蛋白特征肽5B-391213309酪蛋白特征肽B-568*

30116394.5（内标）2853012975*4022酪蛋白特征肽7K-

626.52494024酪蛋白特征肽K-492*45188630（内标）2494522*为定量离子定性判定

5.7按照上述条件测定待测液和混合标准工作液，如果试样待测液中色谱峰的保留时间与混合标准使用液中某一组分保留时间一致（变化范围在之内），试样待测液中色谱峰定性离子对的相对丰度±

2.5%与浓度相当的混合标准使用液相对丰度一致，相对丰度（k）偏差不超过表3规定的范围，则可判定为试样中存在该成分表定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差3相对离子丰度（％）k50%50%，k20%20%2k10%kW10%允许的最大偏差（％）±20%±25%±30%±50%分析结果的表述6试样溶液中各酪蛋白亚型的浓度计算

6.1溶解的试样中各酪蛋白亚型的浓度按式

（1）计算:错误!未找到引用源。