还剩1页未读,继续阅读
文本内容:
质粒提取常见问题解答在一代测序或者去内毒素大提质粒时经常会发生一些质粒提取得率很低影响测序或大提质粒得率的情况可从以下几种情况作出改善第一种情况.没有提出质粒或者质粒收获量很低,可能原因如下:菌种老化A建议对于甘油保存的菌种,需要先进行活化,涂布或者划线菌种,重新挑选单菌落进行液体培养,并对菌种进行初摇活化,按照的比例进行菌种培养二次培养时间最好不要1:500超出小时(或者不超过)16OD
6003.0o低拷贝质粒B建议如果是由于低拷贝质粒引起的质粒收获量低,可以采用两倍的菌体量,并相应增加各种的用量Buffer质粒丢失C建议某些质粒在次继代培养的过程中会出现丢失的想象,另外检查筛选抗生素的浓度是否正确裂解不充分D建议如果采用超过推荐量的菌体进行质粒制备,会导致菌体裂解不充分可适当减少菌体的用量或者相应增大各种的用量并确保细菌混悬均匀Buffer中有沉淀未溶解E Buffer建议和在温度较低时会出现沉淀,使用前请检查是否有沉淀生BufferBl BufferNLBufferCl成,如果有沉淀生成,请置于温育片刻,待溶液澄清后使用37c中未加入要求量的乙醇F DNAWash Buffer建议按照说明书要求加入要求量的无水乙醇,使用后旋紧瓶盖,防止乙醇挥发另外对于质粒中提,大提等,要求用乙醇洗涤,请确保乙醇的体积不小于70%70%离心柱中乙醇残留G建议漂洗后,可适当延长离心时间,尽量去除残留的乙醇另外对于质粒大提,建议离心后,将柱子或大漏斗用吹风机冷风吹片刻或置于65℃烘箱,以彻底去除残留的乙醇,便于洗脱和后续实验操作洗脱液加入位置不正确H建议洗脱液应加在膜中央,已取得最好的洗脱效果洗脱液值不正确I pH建议将从柱子上洗脱下来的最适值在之间,如果洗脱液的超出此范围将会DNA pHpH显著影响洗脱效果,请使用试剂盒配套的日进行洗脱,如果ution BufferpH
8.5,10mMTris-HCI用进行洗脱,请确保在之间ddH2O pH洗脱体积的选择J建议洗脱体积将会影响最终的收获量,洗脱体积越大,收获量越高,但是浓度将会降低请使用试剂盒推荐的洗脱体积进行洗脱,以保证最好的收获量和浓度如果需要高浓度的质粒,请减少洗脱体积另外,如果想收获高浓度高收获量的质粒,请根据试剂盒要求进行二次洗脱,再用推荐的方法进行沉淀,浓缩质粒洗脱时间的选择K建议加入洗脱Buffer后,室温放置2・5分钟,将有利于洗脱第二种情况质粒纯度不高蛋白质污染A建议选择推荐量的菌体,离心后小心吸取上清,如果上清液中混有悬浮物,可再次离心,以彻底去除蛋白另外如果用作为稀释溶液烦]定比值,比值可能较低,造成蛋ddH2I0D白污染的假象,可用的来稀释pH
8.0TEBuffer污染B RNA建议检查配送的是否完全加入到中,加入后,应RNaseA BufferAlRNaseA BufferAl/RNaseA该存放在4℃,如果存放时间过长,或者没有正确存放,RNaseA活力下降,请重新加入RNaseAo基因组污染C DNA建议加入后,轻轻颠倒混匀,避免剧烈震荡涡旋,加入的处理时间最BufferBl BufferBl好不要超过分钟5菌株为含内源核酸酶的宿主菌株D建议请选用含内源核酸酶的宿主菌株质粒提取试剂盒,或者转化质粒到不含内源DNA核酸酶宿主菌株中。