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猪圆环病毒型聚合酶链式反应检测方法31范围本标准规定了猪圆环病毒3型Porcine CircovirusType3,PCV3的聚合酶链反应Polymerase ChainReaction,PCR试验方法本标准适用于猪圆环病毒3型的快速诊断、检测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本包括所有的修改单适用于本文件GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范3原理聚合酶链反应或多聚酶链反应Polymerase ChainReaction,PCR,又称无细胞克隆技术,是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法PCR由变性、退火、延伸三个基本反应步骤构成,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理,合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性一退火一延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”,经过2530个循环后,理论上可使基因扩增109倍以上每完成一个循环需2min-4〜min,2h-3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍4试剂和材料
4.1水GB/T6682,一级水
4.2蛋白酶K溶液20mg/mL配制见附录A.
14.310%十二烷基硫酸钠SDS溶液,H
7.2配制见附录A.2P
4.4Tris平衡酚
4.5三氯甲烷
4.6无水乙醇
4.770%乙醇:配制见附录A.
34.
80.5XTBE缓冲液:配制见附录A.
44.9电泳级1%X脂糖:配制见附录A.5o
5.10DNA核酸染料
6.11DNA Marker
20007.12引物:——P15-TACCACAGAAGGCGCTATGTCG-3;——P25-ATCCGCATAAGGGTCGTCTTGC-35仪器设备
8.1电子天平感量为
0.001go
8.2微量移液器(最大量程分别为10UL、20uL.100u L、1000uL)o
8.3低温高速离心机
8.4PCR仪
8.5稳流稳压电泳仪
8.6水平电泳槽
8.7凝胶成像系统6样品
9.1样品采集按NY/T541—2016无菌采集血清或猪淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织
6.2样品处理
6.
2.1血清直接用于DNA提取
6.
2.2淋巴结、肝脏、肺脏、脾脏和肾脏等器官组织各1g剪碎放于灭菌的研磨器中磨碎,用生理盐水1:5倍稀释,取悬液反复冻融3次,5000g离心15min,取上清液-20°C保存备用7操作步骤
7.1病毒DNA的提取
7.
1.1取上清液(或血清)500UL加入10%SDS溶液50uL、20mg/mL蛋白酶K溶液10uL,于55℃水浴2h~3ho
10.
1.2加入200uL Tris平衡酚,混匀,4℃12000g离心15min
11..3取上清液500uL,加入200口L Tris平衡酚和200uL三氯甲烷,4℃12000g离心15min
12.
1.4取上清液400uL,加入200uL三氯甲烷,4℃12000g离心15min
13.
1.5取上清液300nL,加入2倍体积的无水乙醇,-20℃静置20min,4℃12000g离心15mino
14..6弃上清液,加入1mL70%的乙醇冲洗沉淀表面及管壁,弃乙醇,晾干
15..7加入20UL灭菌一级水溶解沉淀,-20℃保存备用
16.2聚合酶链式反应(PCR)操作流程
17.
2.1PCR反应体系配制按表1中1-7的循序配制表1聚合酶链式反应体系110反应缓冲液
5.0n L2dNTP混合液10mmol/L
4.0nL表1聚合酶链式反应体系(续)3P110nmol/L
1.0uL4P210umol/L
1.0u L5DNA
4.0口L6TaqDNA聚合酶8U/uL
1.0u L7补足至总体积
50.0uL灭菌水
7.
2.2PCR程序设定每次PCR均应设一个阳性对照和阴性对照(用灭菌水作为模板),具体参数见表2表2PCR反应程序设定温度时间194℃4min294℃20s350℃30s472℃1min5重复步骤2440个循环〜672℃5min
7.3电泳操作电压100V电泳40min,并在凝胶中加入DNA核酸染料,在DNA凝胶成像系统仪下观察并拍照8结果分析和判定电泳反应结束后,如果阳性对照孔出现330bp大小条带,阴性对照孔无特异性条带,则试验成立在试验成立的条件下,若泳道扩增出大小为330bp片段判为疑似阳性样品(说明样品中疑似含有猪圆环病毒3型),将目的条带进行序列测定,经序列分析后确认为阳性样品(说明样品中含有猪圆环病毒3型),无特异性扩增的泳道判为阴性9试验材料处理
9.1病料的无害化处理对确诊为PCV3阳性的病料应采取深埋、焚烧等方法对病料进行无害化处理
9.2试验材料处理对于PCR过程的废弃物应放置于专门处置危险废弃物的容器内,通过高压消毒等处理后达到生物学安全标准后才能运出实验室处理附录A(规范性附录)试剂的配制A.1蛋白酶K溶液(20mg/mL)蛋白酶K100mg灭菌一级水5mLA.210%十二烷基硫酸钠(SDS溶液,pH
7.2)十二烷基硫酸钠10g灭菌一级水80mL浓盐酸调pH至
7.2灭菌一级水加至100mLA.370%乙醇无水乙醇70mL灭菌一级水30mLA.
40.5XTBE缓冲液Tris108gNa EDTA.2H
207.44g2硼酸55g灭菌一级水1L,配成10XTBE缓冲液取10XTBE缓冲液25mL,加灭菌一级水475mL,制成
0.5倍的工作液A.5电泳级1%X脂糖X脂糖
0.6g
0.5XTBE缓冲液60mL。