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江苏省科技计划项目验收报告项目名称水溶性水飞蓟素提取加工技术研究及产品开辟项目编号BE2022321项目负责人何尔群承担单位江苏健佳药业有限公司起止年限年月年月20221〜202212以最佳工艺进行验证实验,结果表明该工艺重复性和稳定性好,适于大生产正交实验结果影响因素实验号—水飞蓟宾%水飞蓟素%综合评价ABC
111119.
2119.
613.
366212228.
8921.
714.
014313339.
4520.
813.
9904212310.
2322.
615.
1785223110.
3423.
815.
7246231211.
2825.
216.
8487313210.
6724.
316.
1228321312.
0925.
917.
6149332111.
7625.
617.296K
110.
89510.
78010.
82911.047K
211.
98711.
37210.
19011.043K
311.
19412.
92411.
05410.984R
0.
2990.
5920.
3620.063方差分析方差来源SS fS FP溶剂用量A
0.
14045420.
0702317.
70080.05乙醇浓度B
0.
57141420.
2857172.
01280.05提取时间C
0.
2022820.
1003925.
30350.05误差项D
0.
00793520.00397故最终确定水溶性水飞蓟素的最佳提取条件为提取时间为小时,提取23遍,温度控制在℃溶剂量为物料倍,为如太高,会破坏黄酮母80,8pH8-
8.5,pH核,含量会下降,太低又会影响产品收率⑶包合技术由于碱水提取时,总含量均大于但由于不断去杂,精制40%,时,黄酮损失很大,所以在提取完成后加入按成品量倍的包合剂,将有效成份1进行包合,确保有效成份不损失且水溶性又好澄清以加入澄清剂后所产生的絮状物的分量为指标,通过试验确定澄清4剂的加量为提取溶媒的澄清条件为1%,pH=8-
8.5o分离根据水溶性水飞蓟素的特点,首先采用高速旋转分离,转速516000转/分钟,进料速度直接去除大颗粒杂质,接着采用微孔膜,进800L/h,
0.22|jm一步膜滤,使滤液出来彻底达到注射级标准浓缩由于水溶性水飞蓟素不宜在高温环境下长期受热,我们采用了旋转6刮板浓缩,使得物料在整个过程中始终处于一个动态作用下,不易结垢,不易炭化通过试验确定浓缩的条件为温度℃蒸汽压力<真空度>60,
0.1MPa,-
0.08MPa干燥在试制过程中,采用喷雾干燥,使水溶性水飞蓟素瞬间受热,这样7既不破坏有效成份又使物料不炭化,确保产品在水中有极好的溶解性通过多次试验,确定干燥的条件为进口温度℃出风温度℃进料速度140,80,150Uh
2、水溶性水飞蓟素提取与加工技术路线综合以上研究结果,制定水溶性水飞蓟素提取与加工的工艺技术路线如下:水飞蓟种子榨油一水飞蓟油水飞蓟饼厢工饲料一水飞蓟讣—提取碱水<—纯化水I—I I浓缩去杂<澄清剂101调节值PH浓缩醇沉<--乙醇80%浓缩、回收乙醇I干燥重溶—纯化水分离浓缩真空干燥、粉碎水溶性水飞蓟素成品本工艺的关键技术如下()用碱水提取水溶性水飞蓟素时,碱水的浓度对提取过程有很1大的影响若碱液浓度过高,在提取加热时会破坏黄酮而在加酸酸化时,酸性也不宜过强若酸性过强,会使析出的黄酮类化合物又重新溶解,降低产品收率()工厂化生产采用多功能提取罐生产,而水飞蓟饼一旦遇到水即会形成浆2糊状,从底部很难出液,从而形成出液效率低,产品收率低及诸多不利因素现有的提取罐不适合水溶性水飞蓟素的提取本项目将对提取罐底部进行改造,设计出一种专用提取罐用于水溶性水飞蓟素的工业化提取()澄清剂的选择及其用量对产品中有效成份的含量及澄清度有很大影响3澄清剂选择不当,会影响水溶性水飞蓟素的得率及其纯度
3、水溶性水飞蓟素化学成份的分析()水飞蓟宾的分离与纯化1仪器与材料柱层析用硅胶(青岛海洋化工厂产品);旋转蒸发仪Buchi RII实验方法
①柱层析分离洗脱剂的选择取水溶性水飞蓟素溶于少量乙醇,硅胶板点样,分别用乙酸乙酯、氯仿5mg甲醇()、氯仿甲醇()、氯仿乙醇()、乙酸乙酯石20110191油酸()为展开剂,碘蒸汽显色,做薄层检验通过薄层层析分析,选择乙11酸乙酯或者氯仿甲醇()作洗脱剂201
②柱层析分离水飞蓟宾用硅胶填充柱将目柱色谱硅胶用乙酸乙酯(或者氯仿甲醇100-200)搅拌均匀,将玻璃柱均分为等分,灌入约柱高的硅胶,下口用脱=20164/6脂棉塞住拌水溶性水飞蓟素硅胶粉将水溶性水飞蓟素溶于乙酸乙酯(或者甲醇)30g中,滤去不溶解的杂质,向滤液中加入约等于柱的硅胶,充分拌匀使溶剂挥1/6干,装入柱中,上面用脱脂棉塞住浇柱用洗脱剂浇柱,用锥形瓶接收淋洗液,直至淋洗液无色透明为止浓缩淋洗液经旋转蒸发浓缩后,用薄层色谱检测单斑的为纯品水飞蓟宾,将接收瓶中含纯品的液体合并,回收溶剂,浓缩干燥得白色晶体即为纯品水飞蓟宾结果与分析经薄层色谱检验,观察了硅胶板上各点的高度,比较不同的展开剂的值,Rf并与标准品对照通过比较选用乙酸乙酯或者氯仿甲醇()作洗脱剂进行201试验结果用乙酸乙酯作洗脱剂由于溶剂极性很大,其流出速度太快,效果不是很理想(氯仿)(甲醇)效果比较理想,因此选用(氯仿)(甲n n=201n n醇)作洗脱剂=201()2水飞蓟宾的鉴定状态白色晶体,熔点(显微熔点测定仪),与标准品对照
164.5-1656C一致粉试验玫瑰红色;与溶液反应深黄色;与浓反应HQ-Mg NaOHH2SO4黄色()处有肩峰,与文献谱图一致UV AMeOH=288nm,K=330nmmax/薄层色谱检验用色谱用硅胶板(青岛海洋化工厂产品),其(氯Rf=
0.44仿乙醇展开剂,碘蒸气显色)=9I、、、、、、、、、IR
315016501520147013801285120011751135、、、、、、处有峰()1090104510301005965830800cm-i
04、水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究与制定()1水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究材料与仪器、试剂水飞蓟宾标准品(含量>纯,中国药品生物制品检定所);水
99.5%,HPLC溶性水飞蓟素产品由本公司自制,批号为、、00709212022110820221209c岛津高效液相色谱仪;日本岛津检测器;浙江大学LC-10A SPD-10A N2000色谱工作站;电子天平METTLER AE240甲醇为色谱纯,水为纯净水,其余试剂均为分析纯方法与结果色谱条件色谱柱();以甲醇-水-冰醋酸AichromBond-C185|jm,
4.6x250mm()为流动相,检测波长为理论板数按水飞蓟峰计算应不
50500.5288nm,低于5000对照品溶液的制备精密称取经℃减压干燥小时的水飞蓟宾对照品适量,加甲醇溶解并定量603稀释制成每中约含水飞蓟宾的溶液,作为对照溶液1ml
0.1mg供试品溶液的配制取本品精密称定,置量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻
0.11g,50ml度,摇匀,精密量取置量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品5ml,50ml溶液线性关系考察取对照品溶液、、、、山,分别进样,按上述色谱条件测定峰面积246810积分值,以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程得水飞蓟宾结果表明水飞蓟宾含量在Y=
871.66X-
0.4488,r=
0.9999o%内线性关系良好
0.020~
0.100精密度实验取对照品溶液,在上述色谱条件下重复进样次,每次水飞蓟宾的峰面65L,H积为说明该方法精密度良好RSD
1.09%,重复性试验取水溶性水飞蓟素产品(批号)共份,分别前述样品溶液制备202209216方法和色谱条件操作,计算含量结果显示水飞蓟宾的平均含量为
11.129%,说明该方法有良好的重复性RSD=
1.1%,加样回收率测定准确称取水溶性水飞蓟素产品(批号其中水飞蓟宾含量为20220921,)份,每份分别精密加入水飞蓟宾对照品溶液(浓度为
11.129%
510.0mg,25ml)精密加入甲醇至按前述样品溶液制备方法及色谱条件
0.010032mg-ml-1,50mI,和测定方法,进行含量测定结果显示水飞蓟宾平均回收率为
97.28%,R8D=
1.0%,说明该法回收率良好样品分析精密称取各批次样品各份,按前述样品溶液制备方法及色谱条件和3测定方法,测定水飞蓟素含量,用外标法,根据峰面积计算含量,结果其含量分别为
11.364%,
10.865%,
11.250%o结论与讨论在本实验所确定的条件下,水溶性水飞蓟素产品中的主要成份水飞蓟宾能很好地分离,且重现性、精密度较好,可以作为水溶性水飞蓟素的质量控制方法2水溶性水飞蓟素产品质量标准的制定根据以上研究结果,制定水溶性水飞蓟素产品质量标准如下:水溶性水飞蓟素质量标准本品为菊科植物水飞蓟的果实,经提取所得Silybum MarianumLGaertn的松散粉末,按干燥品计含水飞蓟素以水飞蓟宾计算C25H22cU不得少于
25.0%,含水飞蓟宾和异水飞蓟宾不得少于
10.0%o[性状]本品为淡黄色至浅棕色的松散粉末,在水中溶解[鉴别]取本品克,加甲醇振摇,滤过,取滤液,照下述方法试验
0.110ml,取滤液加锌粉少许及盐酸数滴,即显玫瑰红色11ml,取滤液加醋酸铅试液即产生黄色沉淀22ml,1ml,取滤液适量,用甲醇稀释制成每中约含的溶液,照31ml16ug分光光度法(中国药典年版二部附录)测定,在的波长处有2005IV A288nm最大吸收[检查]溶解性取本品克,加纯化水振摇溶解,应澄清1200ml干燥失重取本品,在℃减压干燥小时,减失的分量不得超703过(中国药典年版二部附录)
5.0%2005VID L炽灼残渣不得过(中国药典年版二部附录)
0.5%2005Vffl N重金属取炽灼残渣项下遗留的残渣,依法检查(中国药典2005[含量测定]水飞蓟素(总黄酮)对照品溶液的制备取水飞蓟宾年版二部附录第二法),含重金属不得过Mil H20ppmo对照品约精密称定,置量瓶中,加甲醇适量,水浴加热使溶解,冷却10mg,25ml至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得供试品溶液的制备取本品精密称定,置量瓶中,50mg,100ml加甲醇适量,水浴加热使溶解,冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得测定法精密量取对照品溶液和供试品溶液各分别置量瓶中,分别5ml,25ml精密加-二硝基苯肌溶液(取-二硝基苯脱置量瓶中,加硫酸2,42,
40.5g,50ml使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)置水浴中反应分钟,冷1ml2ml,50-55C50却,加氢氧化钾-甲醇溶液(取氢氧化钾置量瓶中,加水使溶解,10g,100ml30ml加甲醇稀释至刻度,摇匀)稀释至刻度,摇匀,离心分钟,精密量取上清液105ml,置量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,照分光光度法(中国药典年版25ml2005地附录)在的波长处分别测定吸收度,计算,即得WA,490nm水飞蓟宾照高效液相色谱法(vv中国药典年版二部附录)测定2005V D色谱条件与系统合用性试验用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以甲醇-水-冰醋酸(⑸为流动相,检测波长为理论板数按水飞蓟峰计算应50500288nm,不低于5000o测定法取本品精密称定,置量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,
0.11g,50ml摇匀,精密量取置量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液;5ml,50ml另精密称取经℃减压干燥小时的水飞蓟宾对照品适量,加甲醇溶解并定量稀603释制成每中约含水飞蓟宾的溶液,作为对照品溶液精密吸取上述两1ml
0.1mg种溶液各川,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以水飞蓟宾与异水5飞蓟宾峰面积之和计算[类别]肝病辅助用药[贮藏]遮光,密闭,在阴凉处保存[制剂]针剂,冲剂[有效期]年2
三、技术成果
1、研究论文发表情况()1Yong-ping Pei,Jian Chen,Wei-lin Li,et al.Progress inResearch andApplicationof Silymarin.Medicinal andAromatic PlantScience andBiotechnology,in press
一、原计划合同内容
二、项目实施工作总结报告(包括技术总结).水溶性水飞蓟素提取工艺研究
1.水溶性水飞蓟素提取与加工技术路线2水溶性水飞蓟素化学成份的分析
3..水溶性水飞蓟素产品质量标准的研究与制定
三、技术成果4研究论文发表情况
1.专利申请情况
2.技术特点
3.
四、经费使用情况
五、附件陈剑,李维林,任冰如等.水溶性水飞蓟素提取工艺的改进与探讨.2植物资源与环境学报,已接收
2、专利申请情况专利申请号
202210106033.
43、技术特点目前国内普遍的水溶性水飞蓟素提取方法是加入葡甲胺,让水飞蓟素和葡1甲胺进行化学合成所得,产品虽然溶于水,但副作用较大,对人体肾功能有妨碍作用,在国际上不能被客户接受本项目研究利用了黄酮类物质在碱水中溶解的特性,再在无有机溶剂的条件下及时包合,保证黄酮在后道工序不被破坏,所得产品溶于水,副作用较小,在国际上能够被客户接受提出了水溶性水飞蓟素的提取新工艺,并制定了相应的产品质量标准,明2确了该产品的含量指标及普通理化指标,填补了国内这一领域的空白本项目的研究技术在实施时,可以产生两个极富利用价值的副产品一水飞3蓟色拉油和水飞蓟饼饲料,有利于水飞蓟的综合利用
四、经费使用情况单位万元、人员费、会议费
1661.
5、设备费、管理费
222273.
5、能源材料费、基建费
3918、试验外协费、其他相关费用
42092.
5、差旅费、测试及试验费
51.5106
五、附件、江苏省科技计划项目合同书和项目计划任务书;
1、科技研发工作总结(包括技术报告);
2、项目经费决算表;
3、项目所获成果、专利一览表;
4、研制样品的图片及数据;
5、产品检测(测试)报告;
6、建设中的生产线图片及数据;
7、购置的仪器、设备等固定资产清单;
8、证明经济效益指标的产品销售合同等材料;
9、产品质量标准10
一、原计划合同内容
1、主要研究内容本项目是从水飞蓟籽中提取水溶性水飞蓟素通过对原料的预处理、水溶性水飞蓟素的提取、包合技术、澄清、分离、浓缩、干燥等过程的研究与改进,确定水溶性水飞蓟素的提取工艺条件,明确该产品的含量指标及普通理化指标,并完成中试,使水溶性水飞蓟素产品达到工业化生产水平制定水溶性水飞蓟素的质量标准,填补国内这一领域的空白
2、主要技术指标⑴确定水溶性水飞蓟素提取工艺条件,完成中试,达到工业化生产水平;⑵制定水溶性水飞蓟素的质量标准;⑶发表论文2〜3篇
3、参加人员项目承担单位江苏健佳药业有限公司项目参加单位江苏省中科院植物研究所项目负责人何尔群年龄为本项目工作性姓名职称/职务从事专业所在单位别时间%男何尔群56高级工程师药学80江苏健佳药业有限公司男李维林40研究员药学30江苏省中科院植物研究所主要研究人员周志清男经济师经济管理江苏健佳药业有限公司5130徐伯衡男高级工程师药化江苏健佳药业有限公司4260吴振祥男54主任药师药化60江苏健佳药业有限公司任冰如女42研究员植物化学40江苏省中国科学院植物研究梁呈元男助理研究员植物资源江苏省中国科学院植物研究3460J
4、经费预算经费来源预算
1.单位万元合计年年年备注202220222022合计
200906050、省拨款
12525、部门、地方配套
2、承担单位自筹
3175656050、银行贷款
4、其他来源5,项目经费支出预算2单位万元预算数占预算支出总额的比重盼备注合计
200、人员费
131.
5、设备费
29045、能源材料费
38844、试验外协费
452.
5、差旅费
521、会议费
621、管理费
752.
5、基建费
82.
02.
0、其他相关费用9二测试及试验费°05_____________25______________
二、项目工作总结(包括技术总结)
1、水溶性水飞蓟素提取工艺研究()原料的预处理1水飞蓟种子榨油水飞蓟油可以制作色拉油具有色清、味纯、沸点低、易被人体吸收等特点,有保肝养胃功能,无任何毒副作用,是一种高级保健食用油榨油后的水飞蓟饼用于提取水溶性水飞蓟素提取水溶性水飞蓟素后渣饼富含淀粉、蛋白质,因不含任何有机溶剂,经适当加工后即能形成营养成份较高的天然饲料,是养禽、养猪、喂养水产品的极佳饲料()水溶性水飞蓟素的提取2采用碱水的醇溶液为溶剂,以水溶性水飞蓟素的得率和水飞蓟宾含量为工艺考察指标,以提取时间、提取温度、溶剂用量、值为实验因子,通过单因素试验和pH正交试验,研究并优选出了水溶性水飞蓟素的最佳提取工艺条件材料与仪器水飞蓟种子采自于江苏东台本公司种植基地,由江苏省中国科学院植物研究所李维林研究员鉴定为菊科植物水飞蓟(紫花)(())Silybum marianumL.Gaertn的种子电子天平,型数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司),MettlerAE240KQ-10ODE北京普析通用紫外-可见分光光度计,高效液相色谱仪(TU-1901Shimadzu LC-20A泵,紫外检测器)等SPD-20A水飞蓟宾标准品(含量>纯,中国药品生物制品检定
99.5%,HPLC所),其余试剂均为分析纯方法与结果水溶性水飞蓟素提取工艺的单因素试验)值对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响
1.pH分别称取水飞蓟饼分别加入不同值的的碱乙醇于℃500g,pH30%1500ml,80提取遍,合并滤液,浓缩成到流膏,体积在时,加入澄清剂,搅匀,3500ml40g101静置后,分离上清液,浓缩真空干燥,得粗品,再加入倍体积纯化水,充分溶1h20解,离心分离上清液,真空浓缩得成品称取成品分量,计算得率另取成品精密称定,置量瓶中,加甲醇适量,水浴加热使溶解,50mg,100ml冷却至室温,加甲醇稀释至刻度,摇匀,精密量取对照品溶液和供试品溶液各5ml,分别置量瓶中,分别精密加二硝基苯胱溶液(取-二硝基苯肌置25ml2,4-2,
40.5g,量瓶中,加硫酸使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)置水浴50ml1ml2ml,50-55°中反应分钟,冷却,加氢氧化钾-甲醇溶液(取氢氧化钾置量瓶中,5010g,100ml加水使溶解,加甲醇稀释至刻度,摇匀)稀释至刻度,摇匀,离心分钟,精30ml10密量取上清液置量瓶中,用甲醇稀释至刻度,摇匀,照分光光度法(中国5ml,25ml药典年版地附录)在的波长处分别测定吸收度,计算,即得水飞2005WA,490nm蓟素含量另取本品精密称定,置量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,
0.11g,50ml精密量取置量瓶中,加甲醇稀释至刻度,5ml,50ml摇匀,作为供试品溶液;另精密称取经℃减压干燥小时的水飞蓟宾对照品适量,603加甲醇溶解并定量稀释制成每中约含的溶液,作为对照品溶液精密吸1ml
0.1mg取上述两种溶液各川,分别注入液相色谱仪,记录色谱图,按外标法以水飞蓟宾与5异水飞蓟峰面积之和计算试验结果如下图所示值对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响pH由图可以看出,随着碱水值的下降,水飞蓟素和水飞蓟宾的含量明显上升,pH得率水飞蓟素含量水飞蓟宾含量可能是由于太高会破坏黄酮母核,导致含量下降,故碱水提取的采用在pH pH8-
8.5为宜)提取温度对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响
2.分别称取水飞蓟饼加入值为的的碱乙醇于℃、℃500g,pH830%1500ml,9080和℃各提取遍,合并滤液,浓缩成到流膏,体积在时,加入澄703500ml40g101清剂,搅匀,静置后,分离上清液,浓缩真空干燥,得粗品,再加入倍体积纯1h20化水,充分溶解,离心分离上清液,真空浓缩得成品同法分别测定水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量试验结果如1下图所示提取温度对水溶性水飞蓟素得率和水飞蓟宾含量的影响30%25%-20%—得率水飞蓟素含量T水15%飞蓟宾含量A10%■5%■0%--------.,.」.908070温度由图中可以看出,随着温度的降低,水飞蓟素和水飞蓟宾含量在℃达到最高,且此时水和乙醇的公沸点接近,故采用提取温度在℃为宜8080提取水溶性水飞蓟素的正交试验在前期经验的基础上,选择碱水的乙醇液为溶剂,以乙醇用量、乙醇浓度、提取时间为实验因素,每一个因素设个水平,进行()正3L34Q y交实验正交实验的因素和水平溶剂用量(倍)乙醇浓度(%)提取时间()A Bh C16+6+
4401.0+
1.0+
1.028+8+
6351.5+
1.5+
1.5310+10+83020+20+20取榨油后的水飞蓟饼,分别精密称取份,各按表选择的条件分别加
9500.00g入的碱水的乙醇液,于℃提取遍,合并滤液,浓缩成流膏,体积在pH=8803500ml时,加入澄清剂,搅匀,静置后,分离上清液,浓缩真空干燥,得粗品,40g1011h再加入倍体积纯化水,充分溶解,离心分离上清液,真空浓缩得成品加热回流20提取,合并提取液,过滤,浓缩,回收乙醇,水浴(℃)蒸至近干,再于真空干燥60箱中(℃)干燥,干燥器中冷却后迅速称重,粉碎成粉末
600.5h水飞蓟宾的含量测定方法(法)及水飞蓟素的含量测定方法(法)同HPLC UV上)法1对照品溶液的配制和标准曲线的建立精密称取水飞蓟宾标准品适量,以甲醇溶解并配制成含水飞蓟宾浓度为
0.216的溶液mg-ml-i取对照品溶液此分别进样,按上述色谱条件测定峰面积10,12,14,16,18,20积分值,以峰面积积分值为纵坐标,对照品进样量为横坐标绘制标准曲线,计算回归方程Y=
4.30664105X+
2.9658104,r=
0.9999o结果表明水飞蓟宾在
2.16〜X X内线性关系良好
4.32%数据处理及结果对正交实验结果采用综合评价方法,即以水飞蓟宾的含量加权系数、水溶性
0.6水飞蓟素成品得率加权系数作为综合评价指标综合评价分值=水飞蓟宾含量
0.4水飞蓟素结果下表x
0.6+x
0.4,方差分析结果见表,表明乙醇浓度、提取时间对实验结果有显著影响,其中乙醇浓度()影响最大,其次是提取时间()溶剂用量()影响较小由表直观B C,A2分析综合评价值,最佳提取工艺是R ABC,322即乙醇提取三次,每次提取前两次加倍量乙醇,第三次加倍量乙醇30%2h,86。