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食品中罗丹明B的测定BJS201905范围1本方法规定了食品中罗丹明的液相色谱测定方法及液相色谱-质谱/质谱确证方法B本方法适用于半固态调味料、花椒及花椒粉、花椒油、牛肉干、蜜饯、水果干制品中罗丹明的测定和确证B原理2试样中罗丹明用含酸的甲醇水溶液提取后，经混合型阳离子固相萃取小柱净化，采用液相B色谱荧光检测器检测，外标法定量试样中检出罗丹明后采用液相色谱质谱/质谱法进行确证B试剂和材料3除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为规定的一级水GB/T
66823.1甲醇（CH3OH）色谱纯
3.2乙睛（C2H3N）色谱纯甲酸（）色谱纯
3.3CH O
223.4氨水（NH3・H2）色谱纯含甲酸的水溶液取甲酸（）用水稀释至用滤膜（水相）过
3.
50.1%
3.31mL1000mL,
0.22pn,滤后备用
3.650%甲醇水溶液:准确量取500mL甲醇（
3.1）于1L容量瓶中，用水定容至刻度
3.7含
0.1%甲酸的甲醇水溶液取1mL甲酸（
3.3）,用甲醇水溶液（
3.6）稀释至1000mL
3.8含
0.1%甲酸的乙月青溶液取1mL甲酸（
3.3）,用乙睛（
3.2）稀释至1000mL,滤膜（
0.22有机相）过滤后备用含甲酸的乙月青水溶液取甲酸（）和乙晴（）用水稀释至
3.
90.1%
0.1mL
3.335mL
3.2,100mL,混匀含氨水的甲醇溶液取氨水（）用甲醇稀释至混匀（临用现配）
3.105%5mL
3.4,100mL,罗丹明标准品
3.11B罗丹明标准品的分子式、相对分子量、英文名称、登录号见表纯度B CAS1,299%表1罗丹明B标准品的中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子量中文名称英文名称登录号分子式相对分子量CAS罗丹明B RhodamineB81-88-9C28H31CIN2O
3479.01罗丹明标准储备液准确称取罗丹明标准品（精确至）置于
3.12B B10mg
0.0001g,100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，制成浓度为照的标准储备液溶液转移100/mL至试剂瓶中，置于避光保存，有效期为个月-18℃
63.13中间标准溶液准确移取
0.5mL罗丹明B标准储备液（
3.12）于100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，此溶液的浓度为置于避光保存，有效期为个月500ng/mL4c
13.14标准工作溶液用含
0.1%甲酸的乙月青水溶液（
3.9）将中间标准溶液（
3.13）稀释成
0.
0、、、、的标ng/mL
0.5ng/mL
1.0ng/mL
2.0ng/mL
5.0ng/mL
10.0ng/mL
20.0ng/mL
50.0ng/mL准工作溶液临用现配
3.15混合型阳离子固相萃取柱（60mg/3mL）基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物，或相当者使用前依次用甲醇，水活化3mL3mL陶瓷均质子
3.16仪器和设备4液相色谱仪配荧光检测器
3.
13.2液相色谱-质谱/质谱仪配有电喷雾离子源（ESI源）旋涡混合器
4.3离心机转速
4.428000r/mino电子天平感量分别为和
4.
50.0001g
0.01g具塞离心管
4.650mLo组织捣碎机
4.2固相萃取装置
4.3试样制备与保存5半固态调味料
5.1取适量样品，捣碎，混匀，常温保存备用花椒及花椒粉
5.2取适量样品，粉碎后过目筛，常温保存备用40花椒油
5.3充分混匀，常温保存备用牛肉干
5.4取适量样品，捣碎，混合均匀，冷藏保存备用蜜饯、水果干制品
5.5取适量样品，捣碎，混合均匀，冷藏保存备用测定步骤6试样前处理
6.1提取准确称取（香辛料样品称取精确至）试样置于塑料离心管中，
1.
1.12g1g,
0.01g50mL准确加入含甲酸的甲醇水溶液（）混匀，加入陶瓷均质子两颗（调味油试样除
10.0mL
0.1%
3.7,外），于旋涡混匀器上涡旋于离心取提取液层溶液过15min,8000r/min10min,3mL
0.45pm有机相滤膜后待净化
6.
1.2净化准确移取
1.0mL提取液（
6.
1.1）至固相萃取柱（
3.15）中，依次用3mL
0.l%甲酸水溶液（
3.5）、3mL水、3mL甲醇淋洗固相萃取柱用6mL氨水甲醇溶液（
3.10）洗脱目标物，并收集洗脱液，洗脱溶液在45℃下，用氮气吹至近干，残渣用
1.0mL
0.1%含酸的乙睛水溶液（
3.9）溶解（香辛料样液残渣用溶解），过有机相滤膜上机测定
0.5mL
0.22pm仪器参考条件
6.2）色谱柱柱，粒径或性能相当者a C
184.6mmx100mm,
3.5|jm,）流动相为甲酸水溶液（）为乙月青（）梯度洗脱程序见表b A
0.1%
3.5,B
3.2,2）流速c LOmL/min）柱温d35℃o）进样量e10pLf）激发波长550nm；发射波长580nm表梯度洗脱程序2时间min流动相A（%）流动相B（%）Initial
65350.
165356.
030706.
530708.
0653510.06535空白试验
6.3除不加试样外，均按试样同法操作结果计算7试样中罗丹明B的含量按式
0.0025mg/kg,限为
0.005mg/kg；液相色谱质谱确证法的检出限为
0.0025mg/kg,定量限为
0.005mg/kg确证实验10当试样中检出罗丹明时可按附录方法进行确证B ZB附录A罗丹明B液相色谱图Ex:550nm,Em:580nm12-11二10=9=8=7；6:514=312-
0.
01.
02.
03.
04.
05.
06.
07.
08.
09.
010.0min图罗丹明标准溶液色谱图（浓度）A.1B5ng/mL附录B罗丹明B确证实验液相色谱-质谱/质谱参考条件B.l.）色谱柱:柱，粒径或性能相当者a C18100x
3.0mm,L7|nm,）流动相为含甲酸的水溶液（）为含甲酸的乙睛溶液（）梯度洗脱b A
0.1%
3.8,B
0.1%
3.9O程序见表B.1）流速c
0.4mL/min）柱温d40℃o）进样量e1|iLo）质谱参考条件参见h B.2表B.l梯度洗脱条件时间min流动相A（%）流动相B（%）
0.
0080201.
580202.
55953.
55954.
580205.58020质谱参考条件B.2a）离子源电喷雾离子源（ESI源）b）检测方式多反应监测（MRM）C）扫描方式采用正离子模式扫描）电喷雾电压:d5500Vo）置子源温度e550℃o）雾化气压力f
60.0psio）辅助气压力:g
50.0psi）气帘气压力:h
25.0psi）定性离子对，定量离子对，去簇电压和碰撞能量见表i B.2表B.2罗丹明B质谱参数分析物离子对m/z去簇电压V碰撞能量eV
443.2/
399.3*2059罗丹明B
443.2/
355.12081*代表定量离子对注附录B所列参考质谱条件仅供参考，当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳.定性判定B.3按照和的条件测定试样和标准溶液如果试样中质量色谱峰保留时间与标准溶液B.1B.2一致（变化范围在之内），试样中目标化合物的两个子离子的相对丰度与浓度和标准溶±
2.5%液的相对丰度和浓度一致，相对丰度偏差不超过表规定的范围，则可判定试样中含有罗丹B.3明Bo表B.3定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度（％）5020〜5010〜2010允许的相对偏差（％）±20±25±30±50罗丹明的多反应监测离子色谱图见图B MRMB.1■XICof+MRM2pairs:
443.200/
355.100DaID:RhodamirbBLDM-B-2fromSample3S2of2017112O.wiffTurtxSpray Max
1.5e5cps.,x
2.
331.5e
51.0e5--5,0e4-’
0.
00.
51.
01.
5202.
53.
03.
54.
04.
55.
05.5Time,min■XICof+MRM2pairs:
443.200n
99.300DaID:RhodamirbBLDM^-1fromSample3S2of2017112O.wiffTurtxSpray Max.
2.1e5cps.
2.
332.0e5-Ii
1.0e5-QI...,Q A.
10.
00.
51.
01.
5202.
53.
03.
54.
04.
55.
05.5The,min图罗丹明标准溶液多反应监测离子色谱图B.l B本方法负责起草单位成都市食品药品检验研究院验证单位北京市疾病预防控制中心、山东省食品药品检验研究院、辽宁省食品检验检测院、山西省食品药品检验所、四川省食品药品检验检测院主要起草人郭靓、李绍波、叶梅、肖全伟、乔秀明、林红。
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