还剩1页未读,继续阅读
文本内容:
分析方法开发分离度的认识与思考HPLC对于色谱工作者而言,面对复杂成分的检测,分离是首要的关注点无法有效分离意味着无法进行准确的定性、定量检测中国药典通则色谱法规定,高效液相色谱法、离子色谱法及气相色谱法等要求“除另有0500规定外,待测物质色谱峰与相邻色谱峰之间的分离度应不小于
1.52
一、什么是基线分离?基线分离是每一个色谱分离工作者在兼顾效率前提下的终极追求理论上,当分离度等于L5时,即可认为达到了基线分离为什么是“即可认为而不是绝对认为呢?这里面涉及到正态分布/高斯分布,等概念这些概念稍显顽固,我们给予记过并留待察看,暂不深入追30,6究用点色谱参数里常用的名词,再加一点通俗语言来说就是,对称因子为的两个高矮胖瘦L0一模一样的色谱峰,当分离度为时可认为是基线分离比如,下图显示的某药典给出的L51示例图Peak1Peak2图基线分离示例1但是,理论指导实践,实践是检验真理的唯一标准比如说,上面对于基线分离的描述情形,在实际工作中基本不可能,而且说“基本”是为了满足“一切皆有可能”的严谨,否则可以直接说“根本不可能”因为德国哲学家莱布尼茨说,世界上没有完全相同的两片树叶,而每一个色谱工作者都可以说,世上没有完全相同的两个色谱峰实际情况是,往往相邻色谱峰各有千秋,导致同一个分离度会出现完全不同的分离效果比如下图两个不同比例的色谱峰,在不同分离度情况下的分离表现,在分离度・时尤为明显2,06当后峰是前峰的时,还能看出是两个峰吗?1/16JM1/16图分离度及谱峰相对大小(面积)与分离度关系《实用高效液相色谱法的建立》2既然如此,那我们就不要再执念于分离度了,也不要自欺欺人的出具一个显示分离度大于L5的色谱报告而不看实际分离效果了
1.5
二、分离度如何定?很多人都做过仿制药、改良型新药,甚至创新药!的核心技术思想离不开模仿、借鉴,
99.9%还有留给那些从到的“传说”
0.1%01下表列举了从中国药典以及欧洲药典中随机摘录了一些典型的实例,对于分离要求可以说是1“五花八门”表不同品种对于分离度的要求举例1来源品种名称分离度要求乙酰谷酰胺乙酰谷酰胺峰与谷发酰胺峰之间的分离度放大「
7.0茶碱峰与咖啡因峰的分离度应大于咖啡因峰与己酮回工4,中国药典己酮可可碱£减峰的分离度应大于lO.Oo马来酸峰与杂质峰之间的分离度应符介要求杂质峰、依I I马来酸依那普利那普利峰与杂质峰之间的分离度应大于n
4.0,minimum
3.3benveen thepeaks dueto betamethasoneacetate andBETAMETHASONEACETATE醋酸值他米impurity B松醋酸依他米松峰与杂质峰分离度应大了B
3.3BETAMETHASONE杂质nimimuin
1.7between thepeaks dueto impuritiesH andD.H戊酸值他VALERATE与杂质分离度应大于D
1.7o米松BROMOCRIPTINE欧洲药典杂质minimum
1.1between thepeaks dueto impuritiesA andB.A甲磺酸澳MESILATE与杂质分离度应大B F
1.1o隐亭peak-to-valley ratio:minimum10,wliere Hp=height abovetheCLOPIDOGREL baselineof thepeak dueto impurityB andHv=height abovetheHYDROGEN SULFATEbaselineof thelowest pointof thecurve seppratinRthis peakfrom the硫酸履履山格宙峰谷比:杂质疆氯山格雷峰之间的峰peak dueto clopidogrel.B谷比应大卜lO.Oo如果说中国药典中的例子还算中规中矩的拓宽了我们对分离度的认识,那欧洲药典分离度
1.
5、、是什么操作?这种有零儿有整儿的分离度是怎么搞出来的儿?峰谷比又是什么操
3.
31.
71.1作,跟分离度有什么区别,我该怎么选?看完以后什么感觉?眼花缭乱,再加上点眩晕,有点上头!带着一脑门儿的问号,总感觉,法典里透着点草率,严谨中不失那么点随意要不是看在欧洲药典的面子上,领导不得骂的你找不着北?既然欧洲药典都可以这么干,那我们能不能也模仿、借鉴一下?能!大写的而且,在这个彰显个性,鼓励创新的时代里,建议不要做分离度」、这种纯仿制,也不要
13.3假模假式的做一些分离度这种可以尝试做一些分离度、这种或
1.
2.
3.4me-too,
2.
24.4me-better,者大胆一点做一些分离度、这种四不像
1.
032.21
三、如何证明合理性?实际工作中也接触到不少人有这个想法当分离度连中国药典那除另有规定外的都达不到L5时,开始动了定分离度・、的心思但往往只是大笔一挥而已!比如,方法开发及方法验
101.2证时实际分离度为为了日后方法系统适用性通过性的保险起见,怀着一丝的忐忑,带着欧
1.4,洲药典的一丝安慰,标准制定时写下了大胆一点的直接来个L2,
1.0合理吗?有人说之所以定了是来源于耐用性验证时在某条件下的最差分离度暂且不去推
1.2,测该耐用性试验是如何设计的,但我相信大多数情况下对于制定分离度的证明性是不够的
1.2当然,不仅是达不到分离度时的退让,更有很多达到后的前进,比如分离度应大于L
51.5lO.Oo这些数值的制定不仅仅是一个耐用性的探索,更不是冒险或保守之类的估计,而是需要具体的试验设计去验证方法学验证设计(针对分离度或峰谷比制定)简述如下(如有遗漏谬误还请自行脑补修正,朝着目标前进)、拟定分析方法耐用性的关键参数碳酸镂溶液浓度、流速、柱温、色谱柱及仪器
1、拟定关键耐用性参数在日常检测中可能出现的偏离,比如碳酸镀溶液浓度由于配制过程导2致的误差,由于仪器本身性能导致的流速及柱温控制差异,色谱柱批次间的差异,不同仪器(型号、品牌)之间的差异这些差异均可以根据经验及相关的性能确认()进行预先估计,在PQ估计的基础上适当放宽考察、在上述各种拟定的偏离条件下进行分离度考察,确定最差分离度,比如说是在流速
32.2ml/min时分离度为最差的l.lo、在流速分离度为的条件下,设计杂质与杂质的灵敏度(检测限、定量限),
42.2ml/min,
1.1A B线性与范围,准确度(加标回收)试验此时,我们甚至可以在该条件下兼顾其他杂质的再次验证、在最差分离度条件下,各项验证均满足拟定的验证要求时(不一定非得完全按照中国药典5的要求),可以合理的制定所希望的分离度或峰谷比9101此外,尚需说明一点的是,耐用性不是通过性验证,无需拟定范围后追求耐用性试验的通过耐用性的参数应在方法开发阶段已完成边界的探索,并进行了初步的验证;在方法学验证阶段根据开发时的边界,适当调整符合实际使用场景的参数偏离范围并进一步的确认因此,需要根据具体情况,在参数调整后设计不同程度的耐用性验证试验,并没有一个似SOP的参考模板,这是该项验证与其他验证项目最大的不同,也是我们制定非常规要求分离度(比如分离度峰谷比等)的基础
1.0,
10.0,
5.0。