GST共结合纯化法原理、试剂及实验步骤

GST共结合纯化法原理、试剂及实验步骤原理琼脂糖颗粒和诱饵蛋白复合体在洗涤时并不会损失而且所有反应都含有等量的诱饵蛋白为了证明在洗涤期间没有任何材料损失，应使用1/10的GST融合体加样做平行SDS-PAGE凝胶电泳并染色以便更确切地比较GST融合体蛋白带另外，融合蛋白的降解可能导致诱饵蛋白的量减少，尤其是当使用粗提物（见图

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2.1）而不是纯化标记的实验蛋白时在对结合实验蛋白进行定量时必须将降解量计算在内材料与仪器E.coli提取物（溶于琼脂糖颗粒结合缓冲液）[35S]Met标记蛋白质GST融合蛋白（GST和与琼脂糖颗粒结合）1X SDS样品缓冲液凝胶固定液（10%冰醋酸/45%甲醇）离心机和Beckman TLA-100转子微量离心机4℃X射线胶片/储存磷光子屏扫描光密度仪/磷光子显像仪步骤

1.E.coli可溶性蛋白抽提物放置在冰上解冻

2.每个反应取500解冻的E.coli提取物于4℃,175000g（使用Beckman TLA-100转子为70000r/min）离心30min

3.转移上清液（不小于400口1）到2个试管中，每管200口1,并冰浴保存

4.在一支含200ul步骤3获得的上清液试管中加入广5ul[35S]甲硫氨酸标记的实验蛋白，冰浴15min

5.4℃以最大速度微量离心15min,从体外转录混合物中除去不溶性蛋白质聚合体将200U1上清液（含标记实验蛋白和提取物）转移到一个洁净的试管中

6.在另外一支含200步骤3获得的上清液加入20与琼脂糖颗粒结合的GST或GST融合蛋白（诱饵蛋白）并充分混匀每个反应需要25ug GST诱饵蛋白融合体在每个反应中最好加入约20U1琼脂〜糖颗粒以便在洗涤时可见到琼脂糖颗粒的沉淀然而，如果20U1琼脂糖颗粒结合的蛋白质超过25Hg,即可补加未结合谷胱甘肽的琼脂糖颗粒提供必要的体积〜

7.将200ul混匀的琼脂糖颗粒提取物悬液（步骤6）加到含实验蛋白提取物（步骤5）中缓慢摇动于4℃孵育12ho〜

8.4℃以最大速度微量离心反应物1min,沉淀琼脂糖颗粒移去上清液，琼脂糖颗粒沉淀用1ml琼脂糖颗粒结合缓冲液洗涤，共洗3次每次洗涤之后于4℃以最大速度微量离心1mine最后一次洗漆后应小心移去所有液体除去所有液体以确保在分析性SDS-PAGE凝胶上所加的样品量相等可用拧成条的薄型滤纸或带很薄尖头的SDS加样吸头除去最后遗留的几微升液体

9.在每支试管中直接加入25ul1XSDS样品缓冲液并置沸水浴5mino做分析性SDS-PAGE凝胶电泳所需样品量依据不同的诱饵蛋白/靶蛋白对和检测方式而不同加入全部样品可避免加样体积的问题，因为这样就不存在所加样品与未加样品间比率不确定的因素了

10.可选用考马斯亮蓝染色

11.在凝胶固定液中于室温将凝胶固定30min,缓慢振荡干胶并做放射自显影或将它置于一个储存磷光子的屏幕上使用扫描光密度计或磷光子显像仪对X射线片进行定性分析。