组培实验报告

YUNNAN NORMALUNIVERSITY本科学生综合性实验报告学号姓名兰祖凤084120273学院生命科学专业、班级应生08B实验课程名称胡萝卜愈伤组织的诱导培养教师及职称龙维彪（讲师）开课学期至学年第二学期20102011填报时间年月日201163云南师范大学教务处编印实验总结

3.教师评语及评分:签名年月日、有机成分母液的配制3实验序号一实验名称胡萝卜愈伤组织的诱导培养实验时间实验室

2011.4—

2011.6326实验目的

1.、通过本次实验，使学生能熟练准确配制培养基母液和组培室常用的化学1MS试剂、通过本次实验，使学生能熟练准确配制培养基，并能根据实验目的设计适合2的培养基配方、通过本次实验，使同学能够熟练掌握外植体的表面消毒技术和无菌操作技术，3同时能设计和配制胡萝卜愈伤组织增殖培养基、通过本次实验，使同学熟练掌握愈伤组织继代培养的基本操作技术，进一步4熟悉、规范无菌操作技术；设计和配制胡萝卜细胞悬浮培养的培养基实验原理、实验流程或装置示意图.、实验原理

12、培养基母液和常用试剂的配制I MS、大量元素母液的配制11£

11.K比容疝用量K族取量培养从A分体根/•r L1信-/■I/alKNO.190038000大165033000收NH NO4100050元20・切4408800JCU2MQSO*7H,37074004O170MOO、微量元素母液的配制2规定称现液flk!n成分川依取定杏培MS体枳井基/■FT吸收LT/«!hi/-1MnSO*4H O

22.3446042ZnSO7H O

8.

61720426.21240一H BOKI33M:

200100050.831667G家Na MoO•2Hq

0.255024CUSO5H O

0.025542CoCU•6IL0»

0.0255母规定扩称母液配1L液用量取定容大MS种培体枳养基类/ng*倍吸取/■I数/Kft/ml

2.0M2盐酸硫胺素有

0.510盐酸哦哆素200机

100100.5烟酸成2000分100肌醇母规定1广称取母液S1L MS液用量/定容培养成分大倍量/mg种叫r体积基吸类数/«1取L-1fi/ml甘氨酸

2.0100盐酸硫胺素

0.15有盐酸毗哆素

20025050.525机烟酸

0.525成分肌醇

1005000、铁盐母液的配制4母规定扩称母液配n,液定容MS培成分用量大取体积养基种量/■I吸取类/«gft/l186Na EDTA

37.325200250FeSO*7H O

27.

842139、植物生长调节物质母液的配制5•母液称取量母液定容母液浓度2,

4.D/NAA50长节赤霉素10质100•芳氨基嚓610吟种类成分lg体积,1lg/ID

1、其他常用试剂的配制6盐酸Imol•L-1用浓度

36.5%、密度L19g/cm3的浓盐酸配制氢氧化钠lmol・L-l用固体氢氧化钠配制酒精用的酒精来配制75%v/v95%、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制II、胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配方及配制体积1配方基本培养基+琼脂+蔗糖MS1mg/L2,4-D NAA+

0.5mg/L6-BA KT+

0.7%3%配制体积每小组配制

0.5L胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制2配方基本培养基+水解酪蛋白+琼脂+MS2mg/LNAA+

0.lmg/L6-BA+200mg/L

0.7%3%蔗糖＞胡萝卜愈伤组织的诱导

111、胡萝卜愈伤组织的继代培养IV实验设备及材料.、主要实验用具和仪器13冰箱，普通天平，分析天平，各种型号的试剂瓶棕色和白色、电炉，三角瓶，移液管，量筒，烧杯，容量瓶，玻璃棒，医用口杯，精密试纸药勺,称量纸，标签pH pH

5.4-

7.0,纸，封口膜，橡皮筋，电炉，高压蒸汽灭菌锅、三角瓶、搪瓷杯、量筒、100ml500ml25ml和吸管、解剖刀、已灭菌培养皿、酒精棉球、小块纱布、已灭菌培养皿和滤纸、10ml5ml枪状镶子、眼科手术剪、手术刀、酒精灯、三角瓶、或搪瓷杯、100ml5001000ml50ml量筒等、药品和试剂2硝酸镂、硝酸钾、氯化钙、硫酸镁、磷酸二氢钾、碘化钾、硫酸镐、硫酸锌、铝酸钠、硫酸铜、氯化钻、乙二胺四乙酸二钠、硫酸亚铁、甘氨酸、盐酸硫胺素、盐酸毗哆素、烟酸、肌醇、-二氯苯氧乙酸、-蔡乙酸、-革基腺喋吟、浓盐酸、2,4-D2,4NAAa6-BA6氢氧化钠、酒精、蒸储水等培养基母液、琼脂、蔗糖、生长调节物质、蒸储水、95%MS、愈伤组织继代培养基、酒精lmol•L-1HCK lmol•L-lNaOH75%、实验材料3胡萝卜肉质质根贮藏根处于脱分化进程中的外植体实验方法步骤及注意事项

4.、培养基母液和常用试剂的配制I MS（）、培养基的成分1目前，不论液体培养还是固体培养，大多数植物组织培养中所用的培养基都是由无机营养物、碳源、维生素、生长调节物质和有机附加物等几大类物质组成（）、培养基的配制方法2配制培养基的最简单的方法是用市售培养基干粉溶解在蒸储水里，加上蔗糖、琼脂和其他必要的补加物，再加入蒸储水使之达到最终的容积最后调节值，高压灭菌，于pH是制成所需要的培养基如果没有培养基干粉，则可采用以下两种方法来配制一个是按照配方规定的数量分别称量出各种成分，分别使它们溶解于水，然后再将它们混合在一起另一个是先配制一系列的浓缩贮备液（母液），贮存在冰箱内，待配培养基时2〜4c取出，按比例稀释配用此法较为常用（）、培养基母液的配制3MS母液的配制有两种方法一种是配制成单一化合物母液此法适合配制多种培养基都需要的同一种母液另一种是配成几种不同化合物的混合母液此法在大量配制同种培养基时省时省力配好的母液应放在试剂瓶中贮存在配制培养基母液时，为减少工作量可以把几种药品（如培养基中的大量元素或MS微量元素）配在同一母液中，但应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序,以免发生沉淀通常把每种试剂单独溶解后再与别的也已完全溶解的药品混合，或者待前一种化合物完全溶解后再加入后一种化合物混合已溶解的各种矿质盐时还应注意先后顺序，力求把与和错开，以免形成硫酸钙或磷酸钙的不溶物同时,要慢慢地混合，Ca2+SO42-PO43-边混合边搅拌

①大量元素母液的配制培养基中的种大量元素除、、外，剩下的六种可由、、MS9C HKN03NH4NO3CaCI

2、、几种无机盐来供应，它们可配在同一母液中（具体配•2H20MgSO4•7H20KH2P04制见下表）配制的步骤为确定母液的浓度和体积一计算各种化合物用量一称量一分别溶解一混合一定容一装瓶一贴标签一放入冰箱保存注意最后加入CaCI2•2H20

②微量元素母液的配制培养基中的微量元素可由、、、、MS MnSO4•4H20ZnS04•7H20H3BO3KI Na2MoO

4、几种无机盐来供应,它们也可配在同一母液中（具•2H2O CuS04•5H20CoCI2•6H2O体配制见实验原理中微量元素表）配制步骤同大量元素

③有机成分母液的配制培养基中所需的维生素和氨基酸等有机成分母液应分别单独配制具体配制见下MS表配制的步骤为确定母液的浓度和体积一计算各种化合物用量一称量一溶解一定容一装瓶一贴标签一放入冰箱保存亦可配制成混合母液，配制的步骤为确定母液的浓度和体积一计算各种化合物用量一称量一分别溶解一混合一定容一装瓶一贴标签一放入冰箱保存

④铁盐母液的配制铁盐母液宜单独配制，其配制步骤为确定母液的浓度和体积一计算各种化合物用量一称量一分别溶解一混合一煮沸数分钟一调节值至一定容一装瓶棕色一贴标签一放入冰箱保存pH

5.8用时每配培养基取该溶液I L5mL

⑤植物生长调节物质母液的配制对于植物生长调节物质，配制成母液时，通常用或mg•ml-1ppm partsper million,即百万分的浓度，指一百万份重量的溶液中，所含溶质的份数较为方便，一般配制成的母液，这样的浓度便于计算也可避免冷藏时形成结晶

0.5mg•ml-1

⑥其他常用试剂的配制盐酸Imol•L-1用浓度

36.5%、密度L19g/cm3的浓盐酸配制氢氧化钠lmol・L-l用固体氢氧化钠配制酒精用的酒精来配制75%v/v95%配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制倍数、配制者、配制日期母液最好在的冰箱中保存尤其对生长调节物质与有机类物质要求较严2〜4c贮存时间不宜过长，如发现有霉菌和沉淀结晶产生，就不能再使用、胡萝卜愈伤组织诱导培养基配制II、药品及用具的准备

1、培养基母液的准备1MS配制培养基时先将事先配制贮存的母液按顺序放好，并检查这些母液是否已变色或产生沉淀或产生结晶，已失效的就不要取用培养基母液包括大量元素母液、微量元素MS母液、铁盐母液、有机物母液、实验用具的准备2将洁净的各种用具如三角瓶、量筒、烧杯、吸管、玻璃棒、医用口杯、精密试纸、pH封口膜、橡皮筋、电炉等准备好放在指定的位置再将蒸储水、琼脂、蔗糖、生长调节物质、、准备好lmol•L-lNaOH lmol•L-1HCI、培养基的配制步骤2根据需要配制的培养基的量称好所需的琼脂撕碎后放入医用口杯中，

10.7~

0.8%,加入适量的蒸储水估计加入母液后不超过配制总量置于电炉上加热溶解，边加热边用玻棒搅动待琼脂完全溶解后，加入规定用量的母液可事先取好放于一烧杯中，再加入规2定用量的蔗糖，继续加温并不断搅拌，待琼脂煮透后端离火源，根据培养基配方及培养基体积加入所需要的生长调节物质，最后加蒸储水至所需体积、调节培养基的酸碱性至3PH

5.8由于培养基的值直接影响到培养物对离子的吸收，因而过酸或过碱都对植物材料pH的生长有很大影响此外，琼脂培养基的值还影响到凝固情况所以，当培养基配制pH好后应立即进行值的调整最好用酸度计测试，既快又准，如无条件也可用精密pH pH试纸培养基若偏酸时用来调节，偏碱则可用来调节一lmol-L-1NaOH lmol-L-1HCI般来说，当值高于时，培养基将会变硬；值低于时，琼脂不能很好地凝pH

6.0pH

5.0固

（4）、培养基的分装配制好的培养基耍趁热分装，分装时容器口小者可采用漏斗分注，口大者直接加注试管、三角瓶等培养容器加注量占其容积的为宜，果酱瓶每瓶太多既1/4~1/320〜30mL浪费培养基，又减少了培养材料的生长空间；太少又会因营养不良影响生长培养基分装完后，用封口膜封严瓶口，并用橡皮筋扎紧

（5）、培养基的灭菌培养基分装后应立即置于高压蒸气灭菌锅内进行灭菌消毒灭菌时，压力表读数约为

1.0618・（^-2或

0.1061\/^3,121℃时保持15〜30min左右即可为了保证灭菌彻底，在蒸气灭菌锅增压前应先将灭菌锅内的冷空气放尽排净冷空气的办法

（1）可以事前打开灭菌锅放气阀，煮沸，待大量热蒸气排出后再关闭；

（2）也可采用先关闭放气阀，待压力升到

0.351^・071-2或

0.0371\/^3,108℃时打开放气阀排出空气,再关闭放气阀培养基灭菌时应注意培养基消毒灭菌时间不宜过长，也不可超过灭菌锅规定的压力范围；否则，培养基中的蔗糖、有机物质，特别是维生素类物质就会分解，导致培养基变质、变色，甚至难以凝固当灭菌完成后，应切断电源或热源，待灭菌锅内气压接近“0”时，方可打开放气阀，拧开灭菌锅盖取出培养基切勿为急于取出培养基而打开放气阀放气，否则锅内气压下降太快会引起减压沸腾，导致灭菌锅内各容器中的培养基溢出，造成浪费或污染，甚至烫伤工作人员、无菌蒸储水和接种工具准备3在培养瓶中加入蒸用水，封口包扎；分别取枪状镶子把、眼科手术250ml100ml2剪和手术刀各把，用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套;每套培养皿内放入合适滤纸张，12〜3用牛皮纸和橡皮圈包扎成一套；然后和培养基一起统一灭菌胡萝卜愈伤组织的诱导111（）胡萝卜愈伤组织的诱导1

①准备工作接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；消毒溶液、无菌水、装材料的A.a bc容器、剪刀、镶子、培养皿、计时器、待用培养基等的准备实验材料的准备B.准备新鲜健康的胡萝卜根作实验材料；a实验材料的修整、刷洗、冲洗；b用洗衣粉水或肥皂水浸洗后再用自来水冲净c

②植物材料的表面灭菌操作人员洗手消毒（注意问题？）A装材料的容器及玻璃棒用酒精表面消毒B将待消毒的材料浸入的酒精中秒，取出用无菌水冲洗干净C75%10倒入消毒剂并计时D到预定时间后倒出消毒液并用无菌水清洗干净E将材料切块后接种到诱导培养基上F（）胡萝卜愈伤组织增殖培养基的配制2配方基本培养基+水解酪蛋白+琼脂+MS2mg/LNAA+

0.lmg/L6-BA+200mg/L

0.7%3%蔗糖配制流程同胡萝卜愈伤组织诱导培养基的配制、胡萝卜愈伤组织的继代培养IV（）胡萝卜愈伤组织的继代培养1

①准备工作接种室的清洁和消毒；超净工作台的开机和消毒；剪刀、镣子、已灭菌培养皿和滤纸、待用培养基等的准备；实验材料的准备选择装有无污染的已分化出愈伤组织的外植体的三角瓶摆放于净工作台上

②愈伤组织继代培养将上次接种在愈伤组织诱导培养基中的无污染的外植体上产生的愈伤组织剥离转接到愈伤组织继代诱导培养基上，放置在全黑暗条件下进行愈伤组织的增值培养，以获得25C足够的愈伤组织，作为后续实验的实验材料胡萝卜细胞悬浮培养培养基的配制2配方基本培养基水解酪蛋白蔗MS+

2.0mg/LNAA+

0.lmg/L6-BA+200mg/L+3%糖配制流程配制f调节值一封口包扎―灭菌pH►

二、实验报告实验现象与结果

1.从上图可以看出，本次实验不是很成功在两瓶增值的愈伤组织中，有一瓶被细菌或真菌感染，从而导致实验失败而另外一瓶虽然未呈现死亡现象，但是其继代结果不是很好，所增殖的愈伤组织细胞生长状况不良，而且增殖的细胞数很少、对实验现象、实验结果的分析及其结论2之所以会出现以上实验结果，可能是由于。