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1/-/%+1I5Roberts梯度算子
1.
2.2计算方式类似于灰度差分绝对值之和算子,区2x2y别是计算空间中该点%与斜方向点差值的和值1/%,y-/%+1,y+l I+C=22Xyl/x+l,y117一/%+拉普拉斯算子3x3通过计算每个像素点在包含自身的空间中该y4点叫与相邻的上下左右个点差值的和值作为评价标准CO-/%+1,纨”力+靠y0%y1-/%y+ll9能量谱方法
1.3FFT将序列图像应用快速傅里叶变换转换到频域,幅度的平方称为能量谱由于幅度决定了一幅图像中含有的各种频率分量的多少,故可以用能量谱来构造清晰度评价函数/Y1M-1N-1y\12R6xp[T2dFg标律+不]10+/2u,r]y11|=[R2,U VPu,v=F u,r|2=R2u,v+尸〃,”12C=£Z/2u,r+/2〃,o13U V其中和分别是傅里叶变化的实部和虚部;14/2〃M115力%=0,x T心对应的位置为聚焦位置255GZV=EsgnH0z=016J其中m n为图像的长和宽;/,为对应坐标像素点的灰、T度值;为阈值其清晰度评价函数形式如下:GZVx,xGl/%二17LGVx^G^xCZVX LCPX式中为灰度非零值统计函数;为低灰度值统计法5门限与函数关系如图所示,为步长的门限,大s,G2于仿时步长大小为小于且大于时步长为折,小于§2C1GZVX时步长为其中是根据计算得出的值,函C,C16-2066-50数曲线中最大值为二二函数曲线中G X2X3,清晰度为对应的聚焦位置为清晰度为对应的聚焦X/位置为清晰度评价函数作为衡量图像是否聚焦的标准,它的设计基础在于聚焦图像比离焦图像包含更多的细节信息然而,要想让计算机对图像清晰度进行比较,必须要找到一个直观比较的数值,这个数值能够反应在不同聚焦状态下图像质量的好坏传统的清晰度评价函数主要分为3类基于灰度变化、基于边缘检测、能量谱法
1.1基于灰度变化在一张图片中,根据灰度变化的平均程度,计算出灰度平均值,在计算每个像素点的方差,方差和的值用来衡量照片的清晰度,公式如下
1.2基于边缘检测聚焦清晰图像应有较锐化的边缘,由于梯度算子具有各向同性和旋转不变性,可把图像中各不同走向的边缘和线条突出,离焦量越小图像边缘越锐化,所以图像灰度梯度可以用来评价图像的聚焦程度取图像中每一象素点的梯度值并进行汇总具体有以下几种121灰度差分绝对值之和算子SMD通过计算每个像素点在包含自身的2x2空间中,该点x,y与上方和右方相邻点差值的和值作为评价标准2新提出的自动清晰度评价函数
1.3灰度非零值统计函数GZV如图1a、c所示模糊的图像和清晰的图像时发现,模糊的图像细胞的细节都看不到,同时细胞比较暗淡,而清晰的图像,细胞细节明显,颜色比较深在一张照片中每个像素点的灰度值都是在〜255之间,其灰度直方图如图1b、d所示对比模糊和清晰图像的灰度直方图可以看出,模糊图片的灰度值集中在150〜220之间,而其它灰度值的像素个数为零,表明此时图像中细胞的灰度值更接近背景的灰度级,清晰图片的灰度值集中在50〜220之间,而其它灰度值的像素个数为零,此时图像中观察到细胞颜色比较深的地方对应着较低的灰度值将灰度直方图中出现的像素个数不为零的灰度值称为灰度非零值从模糊图像到清晰图像这种灰度零值的变化是有规律的,可以直观的看到在清晰图像中灰度非零值要多于模糊图像的灰度非零值这种变化可以作为评价聚焦清晰的一个标准,其公式为利用GZV清晰度评价对连续40张从离焦到聚焦再到离焦的照片计算GZV函数后绘制出的聚焦曲线,如图2所示,图中横轴为显微镜平台沿Z轴方向移动的距离,纵轴为灰度非零值在一张照片中出现的个数
1.4低灰度值统计法LGV对比图1a、c两幅图片,清晰图像中的细胞明显比模糊图像中的细胞要黑,对应着灰度直方图中灰度值较低的区域而清晰细胞的面积对应低灰度区域的面积一张图片的灰度直方图总面积就是其图像像素点的总数根据图像实际情况,选取一个阈值T,划分出一个有效信息的低灰度区域作为观察区域,如图1d中灰度值50~150之间的类三角形的区域在图像清晰度变化时,对应区域面积的变化可以作为评价清晰的标准,公式为其中阈值的选取办法为,从焦点一侧开始以较小的步长移动至图像焦点另一侧直到图像完全模糊,统计每幅图像出现过最小的灰度值绘成曲线图,如图3所示,图中最小值为35左右,最大值为140,则阈值的选取范围为35至140之间图4为选取不同阈值对同一图像沿Z轴方向移动的清晰度评价函数曲线实验表明,阈值选取的越小,对图像的变化越敏感,但阈值的选取不是越小越好,阈值过小导致其聚焦可见区域变小根据此图像曲线的情况,现阈值选取为80o3变步爬山法传统的盲人爬山法从起始点开始以一个定长的步子去搜索最大值,然后将最大值点作为焦点所在位置该方法无法预知山顶的大致位置,如果起始位置距离山顶较远,则一次聚焦的时间就会过长,在大量采集照片的时候,其效率会较低因此,本文提出了一种改进的盲人爬山法,称为变步长爬山法使用变步爬山法,当起始位置距离山顶较远时,选用大步长迅速靠近,当靠近山顶位置时,采用小步长保证精确度变步爬山法采用灰度非零值统计法和低灰度值统计法这两种清晰度评价函数来进行聚焦其中灰度非零值统计法的特点在于,针对不同细胞照片清晰度函数的取值都在0至255之间,因此可以根据当前位置对应的清晰度值来确定距离山顶的大致长度变步长爬山法的步长一共有3种第一种情况是在焦点附近的位置,用较小的步长S,并采用低灰度值统计法找到焦点位置第二种情况是在远离焦点但是依然能够看到图像的区域,采用灰度零值比较法,用较大的步长S2去找到焦点位置第三种情况是在离焦点更远的地方,只能隐约看到图像的区域,采用灰度零值比较法,用更大的步长S1去找到可见图像的区域聚焦爬山路线如图6所示聚焦起点使用GZV计算得出步长为S2,向焦点方向移动,再次使用GZV计算得出步长为S1,继续移动并使用GZV计算得出,此时的位置已靠近焦点位置,接下来选用LGV函数作为清晰度评价函数,步长大小变为S,继续移动,知道发现越过峰顶,立刻反向移动,结束聚焦聚焦流程如图7所示4实验与分析结合细胞识别项目的要求,清晰度评价函数应该满足1)单峰性在聚焦点两侧,图像聚焦函数单调递减变步爬山法仅能实现单峰的曲线极点搜索,所以单峰是精准对焦的前提2)精准性评价函数的极点应精准对应聚焦焦点3)尖锐性尖锐性越好,能灵敏地刻画图像差异[13]4)高效性计算时间开销较短,能为聚焦提高效率
4.1实验环境本实验基于我们开发的DNA倍体分析系统,其结构如图8所示,具体设备包括
①德国UEYE高清数码摄像机
②数码摄像机适配器
③电动载物台
④控制遥杆
⑤显微镜
⑥显微镜光源盒
⑦控制盒计算机运行环境CPUi5-4460s,内存8G,操作系统Windows7,编程语言VC++,图片大小2048x2048连续的80张照片从离焦到聚焦再到离焦,其照片对应Z轴间隔为10个步长单位,如图9所示细胞DNA显微分光图像自动分析仪结构如图10所示,包括显微成像系统,高清数码摄相机计算机,三维移动平台以及一些辅助配套装置计算机通过两个端口分别控制CMOS摄像机和控制盒,控制盒可以控制平台的移动和聚焦系统工作原理,首先光源通过滤光片照射置于载物平台上的玻片,图像通过显微镜由数码摄像机采集,然后将图像通过USB上传至计算机,计算机计算图像的清晰度后通过移动Z轴改变平台到显微镜物镜的距离,最终移动到一个清晰图像的位置在显微镜对细胞标本进行扫描的时候由于摄像头可视范围有限的原因不能一次将整个细胞标本的图像采集下来,所以需要进行多次采集才能将整个细胞标本的图像获取然后进行图像分析扫描时的移动是通过移动电动载物台来实现摄像头的相对移动,移动所使用的是X轴电机和Y轴电机
4.2清晰度评价函数图11为由自动显微镜下获取的连续80张照片计算得到的评价函数曲线从图中进行单峰性、精准性、尖锐性的比较单峰性比较灰度非零值统计法的出现局部极大值,单峰性较差;低灰度统计法和灰度方差算子法在较大的区域240~700都没有出现局部极大值,单峰性较好;拉普拉斯、灰度差分绝对值之和算子以及Roberts梯度算子在较小的区域380-600没有出现局部极大值,单峰性一般精准性比较图中除了灰度非零值统计法在焦点位置出现多个点精准性较差以外,其余函数在焦点位置均相同且只有一个点,精准性好尖锐性比较灰度非零值统计法、拉普拉斯、灰度差分绝对值之和算子以及Roberts梯度算子这四种函数的尖锐性一般,在焦点附近变化程度一般;灰度差分绝对值之和算子变化较为明显;低灰度统计法变化最为明显表1为几种清晰度评价函数处理照片的时间表格是针对每个清晰度评价函数单独进行时间测试的结果,80张图片已经事先加载到内存中,计算时间仅为计算用时根据表格所示,进行高效性比较高效性比较灰度非零值统计法和低灰度统计法用时最短,灰度差分绝对值之和算子用时最长,其余函数用时相似所以灰度非零值统计法和低灰度统计法高效性最好
4.3实验总结灰度非零值统计函数的聚焦函数曲线在峰值附近不够敏感,并且函数存在极大值不利于最后的聚焦,但是其函数计算用时少如果增大步长即可避免极大的出现,同时与其他函数相比单调区间最大,在离焦点较远的地方依然能够实现聚焦灰度方差算子法的聚焦函数曲线明显要好于其他几种,焦点位置的敏感度较高,但是其计算量大,用时过多,严重影响聚焦效率拉普拉斯、灰度差分绝对值之和算子以及Roberts梯度算子的聚焦函数曲线基本相似,后两者计算所消耗时间相差不大,拉普拉斯用时更多由于这三种函数本身计算的是图像边缘的能量,函数计算较为复杂,因此计算效率会比较低低灰度值统计法的聚焦函数曲在峰值附近敏感度高于其他函数,且其单调性好计算时间仅次于灰度非零值统计函数通过实验对比发现,传统的清晰度评价函数优点是在焦点附近位置敏感度高,缺点是计算时间长,且敏感区间过小当聚焦起始位置距离焦点稍远时,由于其较远位置单调性差,从而导致聚焦失败现针对这两个问题提出了变步爬山法.变步爬山法的聚焦分为细聚焦和粗聚焦两个阶段,其中粗聚焦又分为长距离聚焦和近距离聚焦两个部分两个阶段的函数选取首要条件是计算速度快,其中粗聚焦阶段,初始位置到焦点的距离非常远,且要快速靠近焦点,所以这部分步长比较大,因此要求函数单调区间大,且在较大步长情况下不存在极值点精细聚焦阶段,距离焦点位置较近,使用小步长来保证聚焦的精确度,因此要求函数在焦点附近敏感度r=jo结合以上指标分析发现,低灰度值统计法和灰度非零值统计函数满足条件其中低灰度值统计法与其他方法相比唯一的区别就是计算复杂度较低,且聚焦精度较好,因此可将此函数作为细聚焦的最优函数而对于粗聚焦阶段,聚焦步长较大,灰度非零值统计函数的聚焦函数曲线便不会出现极大值,只有最大值,并且其单调区间较大,因此可作为粗聚焦的最优函数5结论本文针对DNA倍体分析系统对聚焦速度的要求,从清晰度评价函数的计算速度和聚焦搜索策略两方面进行了提升清晰度评价函数方面,提出了速度更快的低灰度值统计法和灰度非零值统计函数,在搜索策略方面,采用了改进的变步爬山法通过实验证明,它的效率与传统的聚焦函数相比有明显的提升下一步的工作是运用机器学习让计算机自动计算低灰度值统计法的阈值参考文献⑴祝世平,房建成.一种新的能量谱-熔图象清晰度评价函数[J].北京航空航天大学学报,1999,256720-
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218.编辑温泽宇在一张图片中,根据灰度变化的平均程度,计算出灰度平均值,在计算每个像素点的方差,方差和的值用来衡量照片的清晰度,公式如下1V11\I Xy££/%,72〃二击1V11\X yy式中:分别是图片的长和宽/%,〉为点%对应的灰度MN值;〃为图像中所有像素的灰度平均值;治所对应位置为聚焦位置基于边缘检测
1.2聚焦清晰图像应有较锐化的边缘,由于梯度算子具有各向同性和旋转不变性,可把图像中各不同走向的边缘和线条突出,离焦量越小图像边缘越锐化,所以图像灰度梯度可以用来评价图像的聚焦程度取图像中每一象素点的梯度值并进行汇总具体有以下几种灰度差分绝对值之和算子
1.
2.1SMD2x2通过计算每个像素点在包含自身的空间中,该点3y与上方和右方相邻点差值的和值作为评价标准“y。