WesternBlot详解及常见问题

Western Blot详解Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进展检测对表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进展检测，对基因的表达产物，可通过融合局部的抗体检测该文主要通过以下几个方面来具体地介绍一下Western Blot技术Contents

（1）原理

（2）分类i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色

（3）主要试剂

（4）主要程序

（5）试验常见的问题指南

1.参考书推举

2.针对样品的常见问题

3.抗体

4.滤纸、胶和膜的问题

5.Marker的相关疑问

6.染色的选择

7.参照的疑问

8.缓冲液配方的常见问题

9.条件的摸索

10.方法的介绍

11.结果分析

（1）原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot承受的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗经过分别的蛋白质样品，转移到固相载体〔例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分别的多肽类型及其生物学活性不变以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反响，再与酶或同位素标记的其次抗体起反响，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分别的特异性目的基因表达的蛋白成分该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达

（2）分类western显色的方法主要有以下几种i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和试验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECLo只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简洁，原理如下（二抗用HRP标记）反响底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP,即发光，可使解答分析一般的结果没问题RR.核内抗原Western Blot内参选择什么适宜？解答可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参SS.转膜时承受电流是否比电压准确，是否依据（）.8mA/cm2,一般1小时左右？解答不是的，半干法推举用恒流，一般依据目的蛋白的大小来确定电流和时间TT.做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot,内参B-actin,GAPDH,那个好？解答选用beta-actin就可以

8.缓冲液配方的常见问题UU.转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？解答转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉Tris—HC1就是Tris盐用HC1调ph值，配置而成VV.预备做大鼠脑子的Western Blot,蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必需要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？解答可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化WW.想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区分吗？解答一般来说提取时参加光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温除非有文献特别指明用特别的方法，一般来说都没有区分XX.最近作了两次Western Blot,不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题

1、检测GAD-分子量67kd,提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测

2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是l:100o假设是一抗的缘由，不会背景都没有把？

3、第一次有不均匀背景，由于一抗过夜时密封袋不均匀后两次无背景显色

4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST,漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为

0.1%,不会是封闭液的问题吧？解答可以在下面几个问题上找找缘由

1.封闭液用5%Milk,漂洗液（washing buffer用TBST）

2.看看一抗是否能work,降到

1203.看看二抗是否有问题YY.加甲醇的目的是什么？解答加甲醇起着肯定的固定作用，由于小分子蛋白质简洁转出去.（特别是在硝酸纤维素膜上，由于NC膜结合蛋白质的力量较弱）ZZ.“转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最终那个T是Tween吗，浓度多大？解答是Tween,配方如下:Tris-Buffered SalineTween-20TBST,Dissolve

8.8g ofNaCh

0.2g ofKChand3g ofTris basein800ml ofdistilled H2O,Add500ul ofTween-20,Adjust thepH to

7.4with HC1,Add distilledH2O toIL,Sterilize byautoclaving.胶片曝光，就可洗出条带主要试剂

31、丙烯酰胺和N,N-亚甲双丙烯酰胺，应以温热以利于溶解双丙稀酰胺的去离子水配制含有29%w/v丙稀酰胺和l%w/vN,N-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,力口H20至100ml储于棕色瓶，4℃避光保存严格核实PH不得超过

7.0,因可以发生脱氨基反响是光催化或碱催化的使用期不得超过两个月，隔儿个月须重配制如有沉淀，可以过滤

2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%w/v

0.lgSDS,lmlH2O去离子水配制，室温保存

3、分别胶缓冲液:

1.5mmol/LTris-HCLpH

8.8:

18.15gTris和48mllmol/LHCL混合，力口水稀释到100ml终体积过滤后40c保存

4、浓缩胶缓冲液:

0.5mmol/LTris-HCLpH

6.8:

6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml lmol/L HCL调至pH

6.8加水稀释到100ml终体积过滤后40C保存这两种缓冲液必需使用Tris碱制备，再用HCL调整PH值，而不用Tris.CLo

5、TEMED原溶液N,N,N N四甲基乙二胺催化过硫酸镂形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合PH太低时，聚合反响受到抑制10%w/v过硫酸胺溶液供给两种丙稀酰胺聚合所必需的自由基去离子水配制数ml,临用前配制.

6、SDS-加样缓冲液:pH

6.

80.5mol/L Tris缓冲液8ml,甘油

6.4ml,10%SDS

12.8ml,筑基乙醇

3.2ml,

0.05%澳酚蓝

1.6mL H2O32ml混匀备用按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合,在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-253,总蛋白量100〃g

7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液:

30.3gTris,188g甘氨酸，lOgSDS,用蒸储水溶解至1000mL得.25mol/LTris-L92moi/L甘氨酸电极缓冲液临用前稀释1倍

8、转移缓冲液配制1L转移缓冲液，需称取

2.9g甘氨酸、

5.8gTris碱、

0.37g SDS,并参加200ml甲醇，加水至总量ILo

9、丽春红染液储存液丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30g加水至100ml用时上述储存液稀释1倍即成丽春红S使用液使用后应予以废弃

10、脱脂奶粉5%w/vo

11、NaN

30.02%叠氮钠有毒，戴手套操作，溶于磷酸缓冲盐溶液PBS

12、Tris缓冲盐溶液TBS:20mmol/LTris/HCLpH

7.5,500mmol/LnaClo

13、Tween2015鼠抗人・MMP-916鼠抗人-TIMP-l

14、过氧化物酶标记的其次抗体

15、NBT溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/mlo

16、BCIP溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/mlo

17、100mmol/LTris-HCLpH

9.

5、18100mmol/L NaCL、1950mmol/LTris-HCLpH

7.5,5mmol/L EDTAo1可以参看分子克隆4主要程序在这主要列举了一些网站上的有关Western Blot的英文资料，读者可以依据自己试验室的实际状况进展调整Western BlotPROTOCOL1Preparation ofBrain MembraneFractions forWestern Blot、2Western Blotting、3Western Blots、4Western Blotting、5General Western Blot Protocol、6Western BlotImmunostaining、7Western BlotAnalysis forTissue、8Western Blotting9^ECM ProtocolsWestern Blot10Western BlottingUsing Chemilp minscence

11、Far Western Blotting

12、Enzyme-Assisted Immunoelectroblotitng13^Western TroubleShooting14Too ManyBands onWestern BlotTipsand hintsfor thestorage ofantibodies5）试验常见的问题指南依据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目仿照！）

1.参考书推举A.对初学者看什么资料比较好？解答《抗体技术i助佥指南》和Antibodies（a laboratorymanual,wrote byEd Harlow,david lane）两本书不错

2.针对样品的常见问题B.做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot（以下简写成Western Blot）,提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开头还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120|J g,换了个santacloz的一抗仍不行是什么缘由？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？解答疑心是样品问题，可能是1,样品不能反复冻融；2,样品未加蛋白酶抑制剂同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂C.细胞水平要做Western Blot,多少细胞提的蛋白够Western Blot解答一般地5*106就足够了D.同一样品能同时提RNA又提蛋白吗，这样对Western Blot有无影响？解答能，没有问题，我们做过E.同一蛋白样品能同时进展两种因子的Western Blot检测吗？解答固然可以，有的甚至可以同时测几十种样品F.假设目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要留意什么？解答假设是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温顺得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性G.我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时常常会觉察只有一局部蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶觉察有的孔全部的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么方法可以解决？解答你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用削减电流延长时间，多加5-10%甲醇H.想分别的蛋白是分子量260kd的，SDS-电泳的分别胶浓度多大适宜？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白简洁作Western Blot吗？解答260kd的蛋白不好做，分别胶用6%,Stacking Gel

3.5%oI.假设上样量超载，要用什么方法来增加上样量？假设需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚解答可以浓缩样品，也可以依据你的目标分子量透析掉一局部小分子蛋白一般地，超载30%是不会有问题的假设已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试

1.5mm的comboJ.蛋白变性后可以存放多久？解答一80C,一两年没有问题最关键两条不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉（也是被酶水解了）K.我所测定的蛋白分子量是105KD,按理说分别胶应当承受

7.5%,但我所查资料却要求分别胶和浓缩胶均承受11%的配方，不知为何？解答卜.述您提到的两种凝胶均可以使用，由于105KD的蛋白在上述两种胶的线性区分范围内，但需留意条带位置L.接下来我预备承受DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知承受这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5%的脱脂奶粉呢？似乎有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？解答不能使用脱脂奶粉，由于脱脂奶粉中含生物素，用BS A代替应当好一点.M.还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？解答Western Blot一般上样30-100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关开头摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，固然背景也就出来了要拿到好的结果，假设抗体好的话比较简洁，抗体不好的话就需要反复地试了，固然有的不适合Western Blot的怎样做也不行所以拿到好的结果不简洁N.做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？解答必需进展研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提（超速离心）还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要留意抑制蛋白酶的活性〔参加P MSF和蛋白酶抑制剂cocktail）,封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用假设一抗为多克隆抗体，使用BS A也是不错的选择O.您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD,在做western要留意什么呢？解答:做200kd蛋白的Western Blot时要留意,分别胶最好选择＞7%的；剥胶时要留神;转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则消灭杂带不知道如何分析）P.有什么方法可以提高上样量？解答可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量Q.我要检测的目的蛋白是分子量或许为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不行以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？解答如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了假设是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机42kd不算大，也不算小，所以，可以依据一般的转移方法实施R.蛋白的上样量有没有什么具体的要求？解答上样量要依据试验的要求来定，假设要求是定量和半定量的Western Blot则上样量要均等，假设只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0・3〃g/mm2oS.一抗，二抗的比例是否重要？解答比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉局部非特异的本底

3.抗体T.做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot,其二抗有何要求？解答对二抗无要求，要看你试验条件来选择，一般推举用HRP标记的二抗U.同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，假设封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了解答不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最正确的抗体稀释度也是不一样的，需要你试验摸索我觉得转膜过夜似乎没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必铺张时间呢至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式一抗固然可以过夜，假设你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们试验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗11500；二抗120230试试另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min,跑一张好膜不简洁，多尽点心吧，这样不会铺张你的时间，只会节约你的时间！V.免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？解答免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原打算簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，自然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间构造限制，煮后变性会消逝假设你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western,而假设抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间〔限于单抗）W.Western Blot中抗体的重复应用问题解答抗体工作溶液一般不主见储存反复使用，但是如抗体比较贵重，可反复使用2-3次稀释后应在2—3天内使用，4度保存，避开反复冻融

4.滤纸、胶和膜的问题X.NC膜\PVDF膜尼龙膜怎样鉴别？解答尼龙膜是较抱负的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最廉价；PVDF膜介于二者之间就结合力量而言尼龙膜结合DNA和RNA力量可达480-600|J g/cm2,可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA力量可达80-100p g/cm2,对于200bp的核酸片段结合力量不强；PVDF膜结合DNA和RNA力量可达125—300|J g/cm2就温度适应性而言尼龙膜经烘烤或紫外线照耀后，核酸中的局部喀咤碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA,结合不结实；PVDF膜结合结实，耐高温，特别适合于蛋白印迹就韧性而言尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易裂开；PVDF膜较强就重复性而言尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用Y.在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？解答PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更简洁跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的Z.检测磷酸化的JNK和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗解答可以AA.转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端〔即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？解答这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡BB.我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？解答用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活CC.承受tank system有什么讲究？解答建议低电压，长时间，〔一般tank System用衡压好点），如28V14—16hrsoDD.做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？解答这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHCEE.膜一般要如何处理？解答一般用甲醇泡泡就可以了FF.假设是6X8转印膜,要加多少一抗解答一抗的稀释度是有说明的，依据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3—5mLGG.上下槽缓冲液有何要求，怎样才能到达最正确效果解答无要求HH.跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么缘由呢？是有的成分不对吗？解答没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了假设过夜，胶里的水分被蒸发，承受保鲜膜包上也可以；也可能母液〔30%聚丙酰胺）有问题，你可以重配制一份观看；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避开找问题麻烦脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩II.膜、滤纸、胶大小有何讲究？解答假设是用的是半干转，挨次为阴极一》滤纸一》胶一》膜一》滤纸滤纸的长宽分别比胶小1—2mm,而膜的长宽分别比胶大1—2mm确定禁忌上下两层滤纸由于过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸JJ.蛋白质的分子量跨度很大，如要分别小21KD,中至66KD,大至170KD,可以一次做好吗？解答这么广的分布不好转移，一般建议21kd和66kd可以一起转，12%SDS-,湿转36V,3—5hrs就可以了，可以依据你试验室的阅历调整；170kd用7%SDS—,48V lOhrs_16hrsoKK.不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？解答可以考虑转移缓冲液中参加20%甲醇〔是指终浓度）（优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》），由于甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合力量，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液参加终浓度

0.1%SDS,也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（

0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6%o太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压/电流；增加转移时间LL.如何选择最适宜的蛋白杂交膜？解答蛋白质印迹杂交是分子生物学试验中极为常用的一门技术选择质量上层、符合要求、便利适用的杂交膜是打算这项试验成败的重要环节依据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择硝酸纤维素膜硝酸纤维素膜是蛋白印迹试验的标准固相支持物在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是格外清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来依据被转移的蛋白分子量大小，耍选择不同孔径的硝酸纤维素膜由于随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越结实但是膜孔径假设小于

0.1mm,蛋白的转移就很难进展了因此，我们通常用

0.45M m和

0.2p m两种规格的硝酸纤维素膜大于20kD的蛋白就可以用

0.45M m的膜，小于20kD的蛋白就要用

0.2p m的膜了，假设用

0.45p m的膜就会发生Blowthrop gh”的现象从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量硝酸纤维素膜的结合力量主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量SS公司承受的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150p g/cm2o由于100%的纯度，因而也大大削减了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用PVDF转移膜PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分别小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，由于硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就查找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序抱负的用品，始终沿用至今PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进展各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围这种PVDF膜，灵敏度、区分率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，格外适合于低分子量蛋白的检测但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进展浸泡饱和1-5秒钟离子交换型转移膜硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是依据离子交换的方式结合生物大分子的由DEAE〔二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子其最适的pH环境为5-7o DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及而.红蛋白的争论这种

0.45pm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting外，还可以用于核酸结合争论还有一种离子交换型膜是竣甲基［CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7o结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序

5.Marker的相关疑问MM.我用的是可视marker〔BIO_RAD,但是电泳总跑不全8条带，请问什么缘由？怎样改善？胶用过8%,10%,12%,都是这样marker是买的解答一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或削减电泳时间试试看固然梯度胶也是不错的选择NN.用的是Roche molecularBiochemicals公司的由lOOkd,75kd,45kd,30kd,20kd,lOkd组成的markero开头做Western Blot时还能够看到marker,固然也仅能观察其中最多三条带用80V进展SDS.电泳，用恒压10V45min转印的前几次做Western Blot时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带消灭再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体Anti-V5-HRP但就是出不来结果，我很茫然感谢您过赐予教导！解答

1、的是Roche molecularBiochemicals公司的由lOOkd,75kd,45kd,3kd,20kd,lOkd组成的markero开头做Western Blot时还能够看到marker,固然也仅能观察其中最多三条带”有的时候，Prestained Marker放久了效果就会变差，电泳是条带不清楚，集中但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不严密转移是多加点甲醇

2、”前几次做WesternBlot时没有进展丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带消灭”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好

3、“再就是把70KD和130KD两个月的蛋白同时在一块胶上进展分析，用培育基样品进展分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体Anti-V5-HRP〕”是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性比照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到

1.5hrso

6.染色的选择OO.WesternBlot哪种染色好？解答⑴阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可到达L5〃g,考马虽然与氨基黑有一样的灵敏度，但脱色慢，背景高丽春红S和快绿在检测后简洁从蛋白质中除去，以便进展随后的氨基酸分析缺点是溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏不能用语正电贺的膜灵敏度低2胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定3生物素化灵敏度位于

1、2之间，可用于任何一种膜

7.参照的疑问PP.是否W6stem Blot试验半定量肯定要加ACTIN内参？解答对于发表文章的试验最好加内参，试验严谨QQ.用BANDSCAN分析结果行吗？。