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附件6动物源性食品中嗟诺酮类物质的快速检测胶体金免疫层析法KJ201906范围1本方法规定了动物源性食品中喳诺酮类物质的胶体金免疫层析快速检测方法本方法适用于生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、猪肉、猪肝、猪肾中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喳、嗯喳酸残留的快速测定原理2本方法采用竞争抑制免疫层析原理样品中的喳诺酮类物质与胶体金标记的特异性抗体结合,抑制了抗体和检测线(T线)上抗原的结合,从而导致检测线颜色深浅的变化,通过检测线与控制线(C线)颜色深浅比较,对样品中喳诺酮类物质进行定性判定试剂和材料3除另有规定外,本方法所用试剂均为分析纯,水为规定的二级水GB/T6682试剂
3.1乙月青
3.
1.1甲酸
3.
1.
21.
1.3分散固相萃取剂I分别称取硫酸镁18g、醋酸钠
4.5g放于研钵中研碎
1.
1.4分散固相萃取剂n分别称取硫酸镁27g、N-丙基乙二胺(PSA)
4.5g放于研钵中研碎甲酸-乙月青溶液乙月青中加入甲酸,混匀
1.
1.598mL2mL甲醇
1.
1.
61.
1.7稀释液脱脂奶粉水
(110)参考物质
3.2啜诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、登录号、分子式、相对分子量见表纯度CAS1,N99%表口奎诺酮类参考物质的中文名称、英文名称、登录号、分子式、相对分子量1CAS序号中文名称英文名称CAS登录号分子式相对分子量洛美沙星1Lomefloxacin98079-51-
7351.35C17H19F2N3O3培氟沙星2Pefloxacin70458-92-
3333.36C17H20FN3O3氧氟沙星3Ofloxacin82419-36-
1361.37Ci8H20FN3O4诺氟沙星4Norfloxacin70458-96-
7319.33C16H18FN3O3达氟沙星5Danofloxacin112398-08-
0357.38C19H20FN3O3二氟沙星6Difloxacin5522-39-
4449.58C28H33N3F2恩诺沙星7Enrofloxacin93106-60-
6359.16C19H22FN3O3环丙沙星8Ciprofloxacin85721-33-
1331.13C17H18FN3O3氟甲喳9Flumequine42835-25-
6261.25C14H12FNO3嗯喳酸10Oxolinic Acid14698-29-
4261.23G3HliNO5注或等同可溯源物质标准溶液的配制
3.
33.
3.1唯诺酮类物质标准储备液(1mg/mL)分别精密称取喳诺酮类参考物质(
3.2)适量,置于烧杯中,加入适量甲醇()超声溶解后,用甲醇转入容量瓶中,定容至刻50mL
3.
1.610mL度,摇匀,配制成浓度为的喳诺酮标准储备液避光保存,有效期个月1mg/mL-20C6喳诺酮类物质标准中间液()分别吸取喳诺酮类标准储备液()于
3.
3.21|ig/mL1100piL100mL容量瓶中,用甲醇()稀释至刻度,摇匀,配制成浓度为回/的唯诺酮类标准中间液
3.
1.61mL材料
3.4金标微孔(含胶体金标记的特异性抗体)
3.
4.1试剂条或检测卡
3.
4.2仪器和设备4移液器和
4.110200|1L1mLo涡旋混合器
4.2离心机转速%
4.3000r/min电子天平感量为
4.
40.01go孵育器可调节时间、温度,控温精度
4.5±1℃读数仪
4.6氮吹仪
4.7环境条件温度湿度(采用孵育器与读数仪时可不要求环境温度)
4.815℃-35℃,480%分析步骤5液体乳直接用于测定,猪肉、猪肝、猪肾用组织捣碎机等搅碎后备用试样的提取
5.2生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳
5.
2.1分别吸取同等体积的液体乳样品与稀释液混合后为待测液猪肉、猪肝、猪肾
5.
2.2准确称取均质后的组织样品于离心管中,加入甲酸-乙睛溶液
2.5±
0.01g15mL5mL
3.
1.5,涡旋混合振荡离心将上清液转入离心管中,分别加1min,5min,4000r/min5min2mL10mL入分散固相萃取剂漩涡混合、再加入分散固相萃取剂后漩涡混
0.6g
13.
1.3Imin
0.6g
113.
1.4合静置分层后取于离心管中,于氮吹仪吹干后用样品稀释液溶1min,1mL10mL60℃1mL解作为待测液测定步骤
5.3检测卡测定步骤
5.
3.1将检测卡平放入孵育器中小心撕开检测卡的薄膜至指示线处,避免提起检测卡和海绵
5.
3.
1.
1531.2用移液器取待测液
5.2300pL,避免产生泡沫和气泡竖直缓慢的滴加至检测卡两侧任意一侧的凹槽中,将粘箔重新粘好盖上孵育器的盖子,孵育器上的计时器自动开始计时,红灯闪烁,孵育3min取出检测卡,不要挤压样品槽,放于读数仪中,读数前保持样品槽一端朝下直到在读数仪上读取结果,或从孵育器上取出后直接目视法进行结果判定试剂条与金标微孔测定步骤吸取待测液于金标微孔中,抽吸次使混合均匀,将试剂条300|1L
5.
23.
4.15〜
103.
4.2吸水海绵端垂直向下插入金标微孔中,孵育从微孔中取出试剂条,进行结果判定5〜8min,注试剂条或检测卡具体检测步骤可参考相应的说明书操作质控试验
5.4每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验空白试验
5.
4.1称取空白试样,按照和步骤与样品同法操作
5.
25.3加标质控试验准确称取空白试样精确至置于具塞离心管中,加入一定体积的诺氟沙星标准中间
0.01g液,使诺氟沙星终浓度为电/按照和步骤与样品同法操作6kg,
5.
25.3结果判定6读数仪测定法
1.1按读数仪说明书要求操作直接读取并进行结果判定,通过对比控制线(C线)和检测线(T线)的颜色深浅进行结果判定目视判定示意图见图lo无效
6.
2.1控制线(C线)不显色,表明不正确操作或试剂条/检测卡无效阴性
7.
2.2检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色深或者检测线(T线)颜色与控制线(C线)颜色相当,表明样品中唾诺酮类低于方法检测限,判定为阴性阳性
8.
2.3检测线(T线)不显色或检测线(T线)颜色比控制线(C线)颜色浅,表明样品中唾诺酮类的含量高于方法检测限,判定为阳性质控试验要求
6.3空白试验测定结果应为阴性,加标质控试验测定结果应为阳性图目视判定示意图1结论7当检测结果为阳性时,应对结果进行确证性能指标8检)则限
8.1生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳、猪肉、猪肝、猪肾中洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、达氟沙星、二氟沙星、恩诺沙星、环丙沙星、氟甲喳、嗯口奎酸为度/3kg灵敏度
8.2灵敏度应N99%特异性应N95%假阴性率
8.4假阴性率应S1%假阳性率
8.5假阳性率应35%注性能指标计算方法见附录A其他9本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便,在使用本方法时不做限定方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前,须对其进行考察,应满足本方法规定的各项性能指标本方法参比标准为《动物源性食品中种唯诺酮药物残留检测方法液相GB/T21312-200714色谱-质谱/质谱法》附录A定性方法性能指标计算方法表性能指标计算表A.1检测结果b样品情况总数a阳性阴性阳性Nil N12N1=N11+N12阴性.二N21N22N2N21+N22总数或N.1=N11+N12N.2=N21+N22N=N
1.+N2N.1+N.2显著性差异(X2)%2=|N12-N21|-12/N12+N21,自由度df=1灵敏度(p+,%)p+=Nll/Nl.特异性(p-,%)p-=N22/N
2.假阴性率(%)二灵敏度pf-,pf-N12/NL=100-假阳性率(pf+,%)pf+=N21/N
2.=100-特异性相对准确度,%cN11+N22/N
1.+N
2.注由参比方法检验得到的结果或者样品中实际的公议值结果;a由待确认方法检验得到的结果灵敏度的计算使用确认后的结果bN任何特定单元的结果数,第个下标指行,第二个下标指列例如Nil表示第行,第一列,表示所有的第一行,表示所有的第二列;表示第一行,第二列NL N.2N12为方法的检测结果相对准确性的结果,与一致性分析和浓度检测趋势情况综合评价c本方法负责起草单位黑龙江省质量监督检测研究院验证单位国家农林副产品质量监督检验中心、国家乳制品质量监督检验中心、海南省药品检验所主要起草人佟晓芳,杨光,赵平,陈薇薇,李春娟,姜金斗,王玉芝,陈坚。