二轮复习高考命题热点十荧光定量PCR技术学案

［高考命题热点十］荧光定量技术PCR命题解读与技术相关的生物学科素养主要体现角度PCR生命观念主要体现

1.⑴物质与能量观扩增目的基因需要模板、原料并消耗能量PCR⑵结构与功能观仪、微量移液管、微量离心管等的使用以及注意事项PCR科学思维主要体现

2.归纳与概括比较技术和体内复制的异同1PCR DNA分析与推理技术中引物的选取2PCR科学探究主要体现

3.⑴实验操作能力探究片段的扩增及电泳实验中反应体系的配方的配制以及实验流DNA PCR程中的动手操作能力实验现象的观察、分析能力对片段的扩增及电泳实验结果的观察、分析2DNA社会责任主要体现

4.扩增的用途包括获取目的基因、对感染疾病核酸检测的诊断等PCR真题引领经典考题面对新冠疫情，我国一直坚持严格防控措施，“零容忍”彰显人民立场制度优势坚持中高风险地区的大面积核酸检测、适龄人群接种疫苗构建免疫屏障是严格防控的主要措施含病素样本痰、鼻咽试子户.提纯病毒RNA病毒游离的荧光eDNA

⑤被降解1，

②染料，能被Z1的基因段标九料不仪器检测到一®R L_一1探针B荧光|国出］「川{!!能被仪器检测到荧光新冠病毒核酸检测常采用检测法，技术流程如下图，

①②③④⑤表示相关步骤RT-PCR⑴步骤

①④需要的酶分别是,若利用技术扩增目的基因的过程中消耗了个引物分子，PCR126则该过程扩增了次DNA⑵步骤

③的目的是,如果该步骤出现失误，对检测结果的影响是o图中的基因探针末端连接荧光基团末端连接淬灭剂当探针完整时，发出的荧35,R,3,Q R光信号被吸收而不发荧光当酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的和发出Q Taq R Q,R的荧光信号被相应仪器检测到在定量扩增过程中，当扩增遇到探针时，探针就会PCR DNA被水解而释放出游离的和随扩增次数的增加，荧光信号填“逐渐增强”“逐渐减弱”R Q,PCR或“不变”新型冠状病毒抗体检测可作为核酸检测的补充，抗体检测的原理是对某人进行4o检测时发现，其核酸检测为阴性，抗体检测呈阳性，原因可能是5预防新冠肺炎的有效措施是接种新型冠状病毒灭活疫苗，灭活的含义是解析

（1）若利用PCR技术扩增目的基因的过程中消耗了个引物分子，且引物分子参与到子代分子中，同时126DNA还有个亲代分子单链也参与到子代分子中，这样子代单链共有2DNA DNA DNA126+2=128,由于DNA分子有两条链，则子代DNA分子总数为128・2=64=26,则该过程DNA扩增了6次

（2）步骤

③是低温复性的过程，其目的是使弓I物A、弓I物B、基因探针与病毒cDNA的目的片段相结合，如果该步骤出现失误，将导致不能降解探针，进而致使存在病毒但无法cDNA,用仪器检测到荧光

（3）图中的基因探针夕末端连接荧光基团（R）,3,末端连接淬灭剂（Q）当探针完整时，发出的荧光信号吸收而不发荧光当酶遇到探针时会使探针水解而释R QTaq放出游离的和发出的荧光信号被相应仪器检测到在定量扩增过程中，当扩增R Q,R PCR DNA遇到探针时，探针就会被水解而释放出游离的和随扩增次数的增加，水解的探针越多，R Q,PCR则英光信号逐渐增强

（4）新冠病毒抗体检测可作为核酸检测的补充，抗体检测利用了抗原和抗体发生特异性结合的原理实现的对某人进行检测时发现，其核酸检测为阴性，抗体检测呈阳性，说明此人体内没有病毒，但检测到了抗体，则说明此人曾感染新型冠状病毒并已康复（或此人已注射新冠疫苗）

（5）预防新冠肺炎的有效措施是接种新型冠状病毒灭活疫苗，灭活是指用物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构，因而灭活的病毒能起到疫苗的作用，即引起机体的特异性免疫反应，产生抗体和记忆细胞，但对机体没有侵染能力，从而提高人体的免疫力答案

（1）逆转录酶、热稳定DNA聚合酶6

（2）使引物A、弓I物B、基因探针与病毒cDNA的目的的片段结合不能降解探针，导致存在病毒cDNA但无法用仪器检测到荧光

（3）逐渐增强

（4）抗原抗体特异性结合此人曾感染新型冠状病毒并已康复（或此人已注射新冠疫苗）⑸用回热点专物理或化学手段使病毒或细菌失去感染能力，但是并不破坏这些病原体的抗原结构练

1.（2022・广州模拟预测）目前我国新型冠状病毒核酸检测的方法是RTPCR,下图为RTPCR（逆转录荧光技术）的原理过程中探针和引物一起与模板结合，探针两侧分别带有荧光基PCR PCR团和淬灭基团（抑制荧光发出），当酶催化子链延伸至探针处时会水解探针，导致荧光基团与淬灭基团分离而发出荧光（荧光强度与探针水解量成正相关）病毒―11111111”1□□口□□口cDNA荧光基团淬灭基团市物来lE**•引物«•/TV探针』」」」」」」」」」」」」」」」」」」工冬「J JJIIIIIIIIIIIII荧光检测请回答下列问题（）技术与体内复制过程相比，两者的复制方式都是过程l PCRDNA oRTPCR中，需先以为模板合成故装置中需添加酶除了加酶，解开双RNA cDNA,cDNA螺旋的方法还有o⑵对新型冠状病毒进行检测时，探针是一段与相同的核甘酸序列⑶通过荧光检测到荧光信号，则可判定该检测样本为性（选填“阳”“阴”）,在相同循环次数条件下，荧光强度与病毒数量呈PCR o⑷为了在没有条件进行核酸检测前及早发现新型冠状病毒，我国于年月日推出新型2022311冠状病毒抗原检测试剂盒作为核酸检测的补充措施，该试剂盒的检测原理是试剂盒中的探针应o采用技术生产解析

（1）由分析可知，PCR技术与DNA体内复制的复制方式都是半保留复制RTPCR过程为逆转录过程，需向装置中添加逆转录酶，以为模板合成体内复制中解开RNA cDNA DNADNA双螺旋的是利用解旋酶，在PCR中则是利用加热解开双螺旋

（2）由图可知，利用探针对新型冠状病毒进行检测的原理是碱基互补配对和复制，当存在病毒时，以病毒的遗传物质DNA RNA逆转录合成探针能与该通过碱基互补配对结合，当进行复制时，会水解探cDNA,cDNA cDNA针，因此探针是一段与目的基因（病毒的基因）中特定核甘酸序列相同的核甘酸序列

（3）若检测到荧光信号，说明探针与被检测物结合后被水解，则可判定该检测样本为阳性，在相同PCR循环次数条件下，病毒数量越多，复制时水解的探针越多，则荧光强度越强，即荧光强度与病毒数量呈正相关

（4）分析题意可知，新型冠状病毒抗原检测试剂盒的原理是抗原与抗体的特异性结合与传统方法生产的抗体相比，单克隆抗体具有纯度高、特异性强的特点，因此试剂盒中的探针应采用单克隆抗体技术生产答案

（1）半保留复制逆转录酶加热（）目的基因中特定的核甘酸序列2⑶阳正相关（）抗原一抗体的特异性结合单克隆抗体

42.（2022•辽宁模拟预测）“实时荧光定量RTPCR”是新冠疫情防控的一把利刃，通常在1〜2h内即可得到检测结果探针是实时荧光定量技术中一种常用探针（如图）其TaqMan RT-PCR1,5,端连接荧光基团（）端连接淬灭剂（）当探针完整时，发出的荧光信号被吸收而不R,3,Q R Q发荧光在扩增过程中，当聚合酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的PCR Taq DNA R和发出的荧光信号被相应仪器检测到，荧光信号的累积与产物数量完全同步（如图）Q,R PCR2请据图回答双链---------DNA探针TaqMan引物、探针与模板链结合探针TaqMan弓您病毒样品RNA新链延伸遇到探针酶切割探针,到的、Taq J.厂释个荧光二眼/@,东；仪器检测新链聚合完成⑴结合图和图分析，“荧光技术”所用的试剂盒中通常都应该含有酶、12RTPCR酶、TaqMan探针、引物、dNTP、Mg2+缓冲剂等这种分子层面的荧光RTPCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点，主要与试剂盒中的、有关⑵根据探针功能分析，探针中碱基序列的设计应主要依据新型冠状病毒（）TaqMan2019nCoV是冠状病毒大家庭中的新的一员，其碱基序列与引起的冠状病毒碱基序列有的相似SARS

79.5%性，与流感病毒碱基相似度也较高，因此在设计探针时TaqMan应筛选出特有序列，以避免（填“假阴性”或“假阳性”）的出现2019nCoV⑶根据图和图聚合酶除了能催化子链的延伸，还能12,Taq DNADNA（）和均属于免疫球蛋白家族，是机体在抗原物质刺激下由浆细胞产生的抗体4IgM IgGIgM/IgG检测试剂盒的原理是,通过检测人体内相应抗体间接证明是否感染被病毒感染后，机体会产生Ig—IgM+IgG IgGIgM+IgGIgG抗体检测M潜伏期发执及抗IgM二省一一系列的变化来抵御这种入侵，其中和的含量会发生如图所示变化IgM IgG至-4-7071421283542-14-707142128351发病后天数再次感染天数通过对患者研究发现，病毒侵入人体后，大约需要天产生抗体，抗COVID195〜7IgM IgG抗IgG体在感染后天时产生通过检测外周血中和不仅可以鉴别是否感染，还可以辨别10-15IgM IgG,再次感染病检测者是近期感染或者是既往感染当核酸检测结果为阳性，（）

（一）时，可判断IgM+IgG检测者为核酸检测结果为阴性，己治愈的患者检测结果应为解析

（1）分析题图图1和图2所示新冠检测基本原理是将新型冠状病毒RNA逆转录为DNA,通过采用多重荧光技术进行鉴定，因此荧光法所用的试剂盒中通常都应该含有逆RTPCR PCR（反）转录酶、热稳定性DNA聚合酶（Taq酶）、TaqMan探针、弓I物、dNTP、Mg2+缓冲剂系等；由图可知，弓物、探针能与模板链结合，故试剂盒中的引物和探针决2I TaqManTaqMan定了这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和高灵敏性

（2）探针是依据新型冠状病毒内部的一段序列（新型冠状病毒逆转录形成的的部分序列）设计的；新型冠状RNA RNADNA病毒（）碱基序列与引起的冠状病毒碱基序列有的相似性，与流感病nCoV—2019SARS

79.5%毒碱基相似度也较高，因此在设计探针时应筛选出特有序列，以避免将流感TaqMan nCoV2019病毒等误判为新型冠状病毒而出现假阳性

（3）根据图1和图2可知，Taq酶除了能催化DNA子链的延伸，还能催化（探针）的水解，探针水解释放出游离供仪器检RNA TaqManTaqMan R测到（）新型冠状病毒基因编码多个结构蛋白，这些蛋白包括多个抗原位点，利用抗原与抗4体特异性结合的原理，可通过抗体检测抗原的存在，从而直接证明样本中含有新型冠状病毒，间接证明机体感染与否；题干中描述病毒侵入人体后，大约需要天产生抗体，（）5〜7IgM IgM+说明感染过病毒，抗体在感染后天时产生，

（一）说明天没有抗体，检测IgG10―15IgG10~15者体为早期感染；核酸检测结果为阴性，已治愈的患者，也就是感染过，体内病毒已被清除，所以应为

（一）（）IgM IgG+答案⑴逆（反）转录引物探针Taq TaqMan⑵新型冠状病毒内部的一段序列（新型冠状病毒逆转录形成的的部分序列）假RNA RNADNA阳性（）催化（探针）的水解3RNA TaqMan⑷抗原抗体特异性结合近期感染核酸检测结果为阴性，

（一）（）IgM IgG+

3.（2022•陕西宝鸡二模）近几年新冠肺炎疫情不仅对人类的健康和生命安全造成威胁，还严重影响了人们正常的生产生活新型冠状病毒（病毒）检测主要有“核酸检测”“抗原检测”和RNA“抗体检测”种请回答下列问题3⑴研究人员研发了核酸检测试剂盒，通过技术可对采集到的核酸序列进行扩增新型冠状病PCR毒核酸快速检测试剂盒的检测原理是若送检样本中存在病毒，则以病毒为模板，在酶的RNA作用下合成反应体系中加入、、和的作cDNA,dATP dTTPdCTP dGTP用是为扩增提供，再加入互补的荧光探针、酶和后，开始扩增，当子链延伸至探针处，会cDNA水解探针释放出荧光基团产生荧光，荧光监测系统接收到荧光信号从而确诊（）年月日国家卫健委发布了《新型冠状病毒诊疗方案试行第九版》将解除隔离及出22022315院标准的值从降到至就是把病毒的核酸循环复制次可检测到病毒存在，即为CT4035o CT4040阳性值从降到至说明定义阳性的标准在（降低、提高）⑶抗原检测是检测唾液、鼻CT4035,腔黏膜或咽喉黏膜中是否存在新型冠状病毒特有的（分子组成）的检查（）我国采用新型冠状病毒化学发光检测试剂盒进行抗体检测，研究人员利用生产单克隆抗体的4技术，生产出能与新型冠状病毒结合的特异性抗体在单克隆抗体制备过程中，当杂交瘤细胞在体外条件下大规模培养时，应定期更换培养液，目的是该o试剂盒能快速准确地检测出病例是利用了单克隆抗体的等优点解析

（1）以RNA为模板合成cDNA的过程称为逆转录，需要逆转录酶的参与反应体系中加入的、、、能够水解产生四种游离的脱氧核甘酸，同时释放出能量，为扩dATP dTTPdCTP dGTP,增提供原料和能量的条件有模板、四种脱氧核甘酸、种弓物、酶（耐高温的PCRDNA2I Taq聚合酶、热稳定聚合酶），因此再在扩增仪中加入互补的荧光探针、种引物和DNADNAPCR2Taq酶（耐高温的DNA聚合酶、热稳定DNA聚合酶）后，开始扩增cDNA

（2）根据题中有关的定义可知，将解除隔离及出院标准的值从降到至说明定义阳性的标准在降低CT40CT4035,

（3）新型冠状病毒由RNA和蛋白质组成，其蛋白质作为新型冠状病毒的抗原，因此抗原检测是检测唾液、鼻腔黏膜或咽喉黏膜中是否存在新型冠状病毒特有的蛋白质的检查

（4）杂交瘤细胞（动物细胞）在体外条件下扩大规模培养时，为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害，应定期更换培养液与传统抗体相比，单克隆抗体的优点有特异性强、灵敏度高、可大量制备，该试剂盒能快速准确地检测出病例是利用了单克隆抗体的特异性强、灵敏度高、可大量制备等优点答案⑴逆转录反应所需的原料和能量（耐高温的聚合酶、热稳定聚合酶）引TaqDNADNA物（）降低2（）蛋白质3（）为防止细胞代谢产物积累对细胞自身造成危害特异性强、灵敏度高、可大量制备

44.（2022・江苏模拟预测）引起新冠肺炎的新型冠状病毒是一种带包膜的RNA病毒，包膜表面有与人体细胞膜表面的受体结合的蛋白疫苗接种和病毒检测是当前新冠肺炎疫情防控工ACE2S作的重要举措请回答下列问题.疫苗的研发和接种I⑴灭活疫苗工业生产上利用细胞能无限增殖特性培养新型冠状病毒，可实现Vero__________________________________________________________________________的目的⑵腺病毒载体疫苗该疫苗主要成分是活的、有复制缺陷、能表达蛋白的重组人型腺病毒S5这种方式生产的疫苗由于重组腺病毒，从而提高了疫苗的安全性⑶重组亚单位疫苗其技术线路是提取新型冠状病毒一通过酶反转录酶聚合RNA RT PCR酶链式反应技术扩增筛选蛋白蛋白中真正与结合的关键部分基因一构建基因表RBD SACE2达载体一导入细胞并培养一提取并纯化蛋白一制成疫苗利用酶技术，获取CHO RBDRTPCR蛋白基因时，需加入酶；扩增蛋白基因时，应选择的引S RBD物为的产物可通过电泳鉴定，设置如下号泳道为标准oPCR1Marker,号泳道是以为材料做的阳性对照组，号泳道为实验组图中233号泳道出现杂带，原因一般有至少答出点基因表达载体构建中为提高目的基因和运载体32的正确连接效率，研究人员应在图中选择的限制酶是1EcoR I引物11EcoR I引物31引物2引物也=;^粉4III

123.III弓I宿獭6t T物8HmdIIBamllP蛋白基因RBD图蛋白基因结构与引物位置1RBD示意图标记基因BamH IHind IIIEcoR I图运载体片段示意图2图3新型冠状病毒的检测H.核酸检测4图是我国自主设计的新冠病毒核酸检测平台示意图，图为实时荧光逆转录聚合酶45RTPCR链式反应示意图当探针完整时，荧光基团发出的荧光信号被淬灭基团吸收而不发荧光；RQ当酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的和发出的荧光信号被相应仪器检测到，TaqRQ,R荧光信号的累积与产物数量完全同步PCR自动化一自动化核酸PCR提取体系配置RT-PCR全白动核酸自动化液体提取全自动分杯纯化仪处理系统处理系统I_.实验室信息管理系统病毒样品RNA双链DNA引物、探针与模板链结合]探针引物TaqManJ■引物2新链延伸遇到探针「腕质藏、酶切割探针5叫酶』.Taq J一^荧光=®，_/©仄祗二/3仪器检测新链聚合完成巴历‘吼]©、”图5

①加入自动化体系配置中的引物和探针的设计依据是引物PCR o和探针与模板结合发生在循环中的阶段PCR

②利用荧光定量仪可监测待测样液中病毒的核酸数量若每断裂一个探针，设置PCR TaqMan发出的荧光信号的值为若经〃次的扩增，实时荧光信号强度（填“增强”“减弱”或R bPCR“不变”），说明样液中病毒的核酸数量为若荧光信号强度值为（〃一）推测样液中病0;a21,毒的核酸数量为o（）抗原和抗体检测5为了及早发现新型冠状病毒的感染者，新型冠状病毒抗原检测试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测的有效补充措施这两种试剂盒的检测原理为对于已注射过灭活疫苗的o人员，应选择（填字母）检测核酸检测抗原检测抗体检测a.b.c.解析（l）vero细胞是指非洲绿猴肾细胞，可用于检查大肠杆菌毒素，作为培养病毒的细胞宿主和真核寄生虫的宿主细胞之所以选择细胞生产病毒，是因为它容易培养，传播稳定，可vero以无限分裂，所以细胞用于生产许多疫苗新冠疫苗细胞的原理是将培养扩增的活病vero vero毒，灭活后经过一系列纯化技术，然后制备疫苗灭活的主要特点是免疫反应强，安全性和稳定性好，运输方便因此工业生产上利用细胞能无限增殖特性培养新型冠状病毒，可实现vero获得大量新型冠状病毒，降低生产成本

（2）重组腺病毒载体疫苗，是利用基因工程技术，把致病病毒的关键基因片段植入到改造后的无害病毒里，重组成疫苗这个疫苗和无害病毒A B一样不致病，却拥有病毒的长相，能使免疫系统认识病毒并产生免疫记忆，从而阻断病B AA,毒的入侵在疫苗研发中，改造后的腺病毒不能在体内复制，也无法整合进宿主细胞基因组A中，所以，从理论上来讲，对人体不会造成危害（）技术是将的反转录和3RTPCR RNAcDNA的聚合酶链式扩增（）相结合的技术

①利用酶技术，获取蛋白基因时，需加PCR RTPCR S入逆转录酶、Taq酶

②扩增RBD蛋白基因时，应选择的引物为引物

4、引物5

③PCR的产物可通过电泳鉴定，设置如下号泳道为标准（）号泳道是以蛋白基因片段为材1Marker,2RBD料做的阳性对照组，3号泳道为实验组

④PCR技术受到温度，酶，所用蛋白材料等因素的影响，出现杂带原因可能是引物的特异性不强，结合到模板的其他地方；模板不纯受到污染，结合到其他模板；目的片段与引物有多处结合；退火温度偏低等原因

⑤根据图可以分析出基因表1达载体构建中为提高目的基因和运载体的正确连接效率，研究人员应在图中选择的限制酶是1（）

①根据原理，加入自动化体系配置中的引物和探针的设计依据BamH IHind III4PCR PCRo是新冠病毒的基因对应的部分核甘酸序列

②引物和探针与模板结合发生在循环中的复性PCR（或退火）阶段

③利用荧光定量仪可监测待测样液中病毒的核酸数量若每断裂一个PCR探针，设置发出的荧光信号的值为荧光强度与核算数量相对应原理，若经〃次的TaqMan R1,扩增，样液中病毒的核酸数量为则说明实时荧光信号强度不变

④若荧光信号强度值为PCR0,a2〃-l,推测样液中病毒的核酸数量为a5为了及早发现新冠病毒的感染者，新冠病毒抗原检测o试剂盒及抗体检测试剂盒作为核酸检测的有效补充措施

①这两种试剂盒的检测原理为抗原抗体结合即抗原一抗体杂交

②对于已注射过灭活疫苗的人员，应选择核酸检测和抗原检测答案获得大量新型冠状病毒，降低生产成本1⑵无法在人体宿主细胞内复制增殖⑶逆转录酶、酶弓物、弓|物提纯的蛋白基因片段模板受到污染；引物的特Taq I45RBD异性不强；退火温度偏低和BamH IHind III新型冠状病毒的基因对应的部分核昔酸序列复性或退火不变4a抗原一抗体杂交5ab。