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文本内容:
一、包装细胞细胞的培养293T
一、细胞的冻存293T随着传代的次数增加,细胞会出现生长状态下降,出现突变等所以要在细胞购
1.293T进时就进行冻存在细胞对数生长期进行冻存,增加细胞复苏成活率
2.,倒去细胞上清液,加入液洗去残留的培养基3D-Hanks,加入的胰酶,消化后倒去
40.25%10-20S镜下观察细胞变圆,细胞间间隙加大时,加入新鲜培养基吹打混匀
5.细胞计数
6.,将细胞离心,7lOOOrpm,2min根据计数结果加入细胞冻存液(完全培养基)重悬细
8.70%+20%FBS+10%DMSO胞,密度为个3x106/ml第二天将细胞放入液氮灌,并记录
10.
二、细胞的传代293T
1.当细胞生长至汇合率达到80〜90%需要对细胞进行传代操作,以扩大细胞数量,维持细胞良好的生长状态消化细胞,方法同上
2.细胞离心结束后,加入完全培养基重悬密度为个
3.3x105/ml分到培养皿中,
4.10cm lOml/mio
三、细胞的复苏293T当细胞传代次数过多(超过代),细胞状态变差时或细胞出现污染事故时,需要丢
1.50弃并对开始冻存的细胞进行复苏.打开水浴锅,设置温度为℃240查看细胞库记录,根据记录从液氮灌中取出冻存的细胞(需戴上棉手套,防止被冻伤),
3.迅速丢入水浴锅中并快速晃动,在1〜2min内使细胞溶液完全溶解将细胞溶液加入完全培养基中并混匀后转入培养皿
4.1ml9ml10cm放回℃、和相对湿度的培养箱中培养
5.373%CO295%第二天观察细胞存活率倒掉旧的培养基,加入新鲜培养基
6.10ml
二、慢病毒的包装、浓缩和滴度测定所用病毒检测引物为特异引物,序列如下
1.WPRES^CCTTTCCGGGACTTTCGCTTT-S1forward primer,S^GCAGAATCCAGGTGGCAACA-S reverseprimer andS^FAM-ACTCATCGCCGCCTGCCTTGCC-TAMRA-S probe
2.TaqMan Universal PCR Master Mix Applied Biosystems,cat.no.
43044373.TaqMan DNATemplate ReagentKit AppliedBiosystems,cat.no.
4019704.TaqMan RNasePcontrol reagentAppliedBiosystems,cat.no.4316844用于包装的细胞的培养293T用于包装的细胞必需选择处于生长旺盛期,细胞状态较佳,293T ATCCNo.CRL-11268存活率以上,细胞边缘清晰,传代次数较低任何时候细胞汇合率都不准达到90%100%慢病毒的包装预先准备个瓶的细胞,培养基为
1.3T150293T DMEM+10%FBS,1%Glutamax,青霉素■链霉素1%将细胞分至分至个瓶中,每瓶的细胞密度是个
2.U12IJ12T1508x106第二天,镜下检查细胞细胞融合度应大致为分布均匀
3.30-40%,转染前小时,取出细胞板,去除原有细胞培养基,加入的培养基,
4.120ml Opti-MEM将细胞送回培养箱取两支无菌的离心管,其中一支中加入5,50ml252pg pNL-载体质粒,包装质粒和EGFP/CMV/WPREDU3168pg pCD/NL-BH*DDD84|jg质粒,用培养基补齐到另一支中加入溶液和pLTR-G Opti-MEM18mI5003Trans-EZ培养基,用电动移液器轻轻混匀将稀释液滴加到质粒管
17.5ml Opti-MEM Trans-EZ中,边加边轻轻晃匀关键步骤推荐使用质粒大抽试剂盒或相当的试剂盒所制备的质粒Qiagen室温孵育分钟,使和充分结合形成转染复合体
6.20DNA Trans-EZ取支的移液管,将得到的复合体均匀滴加入到细胞培养板中,
7.15ml DNA-Trans-EZ每板来回晃动培养板,混匀后放回到二氧化碳培养箱每一皿细胞培养盘不要3ml5%超过盘6小时后,移去细胞上清,更换为的完全培养基
8.617ml DMEM转染后一天观察细胞,所有的细胞应当都是健康的并且密度接近如果所转染
9.60-80%质粒带有荧光,那么这时候可以看到大于的细胞都是带有荧光的GFP95%将细胞送回培养箱继续培养天(小时)在这个过程中,细胞会逐渐融合形
10.236-48成多核体,大多数的细胞依然贴壁收集所有的上清,分装到离心管中
11.50ml℃离心分钟,除去脱落的细胞和大的细胞碎片
12.4,500g
10.总的上清约为用过滤装置过滤如果发现滤膜被堵13204ml,250-ml
0.45pm PVDF住,表现为过滤速度变慢,更换新的滤器慢病毒的浓缩与纯化方法一超速离心沉淀法取个离心管,用乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外1,6Ultra-clear SW2870%灯继续消毒分钟30每个离心管中加入约的预先处理的病毒上清液
2.Ultra-clear SW2832ml取一支的移液管,吸取的蔗糖溶液将移液管一直插入到离心管的
3.10ml12ml20%底部,缓慢将蔗糖溶液打出同样地,将剩下的蔗糖溶液分别加入到另两个离4ml8ml心管中另取一支干净的移液管,对剩下管进行同样处理3用调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超过
4.PBS
0.lg按次序将所有个离心管放入超速离心转头中
5.6Beckman SW
28.小心将管子从转头中取出倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置分钟使剩余的上710清流干吸掉剩余的液滴在管底应当有可见的沉淀每管中加入不含钙和镁的洗下沉淀
8.100ml PBS将超速离心管插入到锥底离心管中,盖上盖子
9.SW2850ml•在℃溶解小时,每隔分钟轻轻震荡104220℃离心分钟,使溶液集中于管底
11.4,500g1用移液器轻柔吹打使沉淀重悬避免产生泡沫将所有管中的液体集中到一个
12.2003离心管中SW28集中后的病毒悬液分装成每份,保存在成品管中用碎干冰速冻后储存在一
13.503℃80o方法二浓缩法PEG-8000(聚乙二醇)是高分子聚合物,具有高亲水性,在溶液中会吸收大量水分,减少病毒PEG之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀浓缩的目的配制称取溶解在5X PEG8000+NaCI NaCI
8.766g;PEG800050g200ml Milli-纯水中;摄氏度湿热灭绝;保存在℃Q12130min30min4,使用滤头过滤慢病毒上清液;
10.45pm
3.每20〜30min混合一次,共进行3-5次;度放置过夜;
4.4度,离心;
5.44000g,20min
6.吸弃上清,静置管子1〜2分钟,吸走残余液体;加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀;
7.集中后的病毒悬液分装成每份,保存在成品管中用碎干冰速冻后储存在一
8.503℃80病毒滴度的测定稀释计数法滴度单位指每毫升中含有的具有生物活性的病毒颗粒数〃TU/ml,’FU为〃〃的缩写,中文为转导单位〃,表示可以感染并进入到靶细胞中的transducing units病毒基因组数第一天细胞准备将生长状态良好的细胞消化计数后稀释至力口入孔板,293T lxl05/ml,96100pl/孔,为每个病毒准备10个孔放入375%CO2培养箱中培养第二天加病毒在管中做倍梯度稀释,连续个稀释度稀释方法如下每种病毒准备个EP
1010101.5ml管,每管加入川培养液,往第一个管中加入病毒原液,混匀后,吸取加EP90103103入第二个管混匀依此类推,做十个稀释度10~10-8吸取孔板中原有的培养基,加入含稀释好的病毒液并做好标记96第三天追加培养液在每个孔再加入完全培养液,利于细胞的生长1003第五天观察结果并计算滴度在荧光显微镜下观察结果,并数出最后两个有荧光的荧光细胞克隆数假设为和则滴X Y,度孑的病毒液的含量印TU/ml=X+Y*10*1000/2/X L1定量法PCR病毒感染天前,取孔板接种细胞每孔细胞为个16HOS5x104接种细胞小时后,取两个孔的细胞用血球计数板计数,确定感染时细胞的实际数目,24记为N弃去其他培养板中的培养基,更换为含有的新鲜培养基将浓缩病毒5|jg/ml polybrene用培养基稀释倍,也就是取病毒加入到的培养基中在个培养孔中分别2001319933加入和的稀释病毒
0.
5.1,503感染开始后小时,除去培养上清,换为含(20500|jl DNaselTakara MirusBio,终浓度为)的新鲜培养基在℃消化分钟,这一步是要除去残余的质粒10U/ml3715然后换为正常的培养基,继续培养小时DNAo2ml48用胰酶溶液消化细胞,在℃放置分钟用培养基吹洗下,
0.5ml
0.25%-EDTA371离心收集细胞按照试剂盒的说明抽提基因组每个样品管中加入DNeasy DNA洗脱液洗下用定量试剂盒定量()基因组可以稳2003DNA DNABio-Rad DNA定保存在℃至少个月-202准备所需的试剂和样品为病毒序列检测引物配总管PCR I2x TaqManMaster Mix25pl xnForward primer100pmol ml-1O.lpl xnReverse primer100pmol ml-1O.lpl xnProbe100pmol ml-1O.lpl xnH2O
19.7pl xn例如总反应数为将n=number ofreactions.40,lml2x TaqManUniversal和PCR Master Mix,4pl forwardprimer,4pl reverseprimer,4pl probe川混和震荡后放在冰上788H2为人基因组序列检测引物配总管口2x TaqManMasterMix25pl xnlOxRNaseP primer/probe mix
2.5pl xnH2O
17.5pl xn例如总反应数为将n=number ofreactions.40,lml2x TaqManUniversalPCR和混和震荡后放在MasterMix,lOOpI lOxRNasePprimer/probe mix7003H2O冰上在预冷的孔板上完成体系建立从总管中各取川加入到各行的96PCR PCRI45A-D孔中,从总管口中各取口加入到各行的孔中分别取质粒标准品和待测样451E-G5|J|品基因组加入到行中,每个样品重复DNA A-D1次另留个孔加入的水做为无模板对照15|jl no-template controlo分别取基因组标准品和待测样品基因组加入到行中,每个样品重复5|jl DNAE-G1次另留个孔加入的水做为无模板对照15pl no-template controlo所使用定量仪为定量系统循环条件设定为℃分PCR ABIPRISM7000502钟,℃分钟,然后是℃秒,℃分钟的个循环9510951560140数据分析测得的样品中整合的慢病毒载体拷贝数用基因组数加以标定,得到每基因DNA组整合的病毒拷贝数滴度integration unitsper ml,IUml-1的计算公式如下:IU ml-1=C xNxDxl000/V其中二平均每基因组整合的病毒拷贝数C感染时细胞的数目约为N=1x105病毒载体的稀释倍数D=加入的稀释病毒的体积数V=慢病毒的储存与稀释慢病毒的储存病毒的运输采用干冰保温,收到病毒液后若几天内用于实验,可于℃保存于一
1.4周内用完若病毒量较大,需长期保存则根据每次实验用量分装后放于冰箱一般病2,-80°C毒可以放于约个月以上,但若超过个月后使用,请重新检测病毒滴度-80°C126避免反复冻融,否则会降低病毒滴度每次冻融会降低病毒滴度
3.10%o慢病毒的稀释需要稀释病毒时,将病毒取出后置于冰上融解,用细胞培养用、或培养D-Hanks PBS基稀释到所需浓度后混匀分装后℃保存,并尽快用于实验于一周内用完4慢病毒在细胞水平的使用什么是MOI〃为〃〃的缩写,中文为感染复数〃或复感染指数〃,MOI multiplicityof infection含义为感染时病毒和细胞数量的比值,即平均每个细胞感染的病毒活性单位数TU)在实验中将某种细胞感染达到时的定义为这种细胞的number/cell80%MOI MOLo与整合事件以及目的基因的表达相关一定范围内,表达水平和呈正相关MOI MOI MOI取决于多种因素,如细胞状态,目的基因的大小与性质,细胞的感染效率等所以,实验前需查阅相关文献,确定慢病毒对目的细胞的亲嗜性、以及在体()注射所需MOI invivo病毒量若无文献支持,可以通过预实验得到合适的实际上,即使有文献支持,但MOI由于所用细胞代数、细胞状态以及目的基因的差异,实际的和文献报道也会不同,所MOI以要安排预实验以确定所需以及病毒对细胞生长的影响MOI目的细胞感染预实验及实验体系的放大实验目的确定细胞感染所需的以及是否需要添加感染增强剂MOI,Polybrene实验材料孔板,管,长势良好的目的细胞一瓶,已知滴度的慢病毒溶液,96l.5ml EP()目的细胞培养基等Polybrene10mg/ml,第一天细胞准备将长势良好的目的细胞接种到板,消化好细胞(悬浮细胞不需要消化,直接离心收集96细胞后加新鲜培养基重悬即可)后把浓度调为3X104~5X104个/ml,按903/孔加入接种细胞数量因细胞的生长速度而略有不同,一般是保证第二天进行病毒感染时细胞汇合率介于之间30~50%第二天病毒感染感染实验分两组,一组直接添加病毒液,一组同时添加病毒稀释方法同病毒Polybreneo滴度测定时方法,倍倍比稀释,共三个稀释度,值依次为和(细胞经10MOI100,101过一天的生长数量约为1x104个/孔,对应的病毒数量为1X106TU、1X105TU和1X104TU)每个MOI值加两个孔,取出一组加入感染增强剂,比例为1终浓度为2000,第二天换液感染实验同一天,小时后,弃去上清液,更换为新鲜培养基,川/孔8-12100第五天观察荧光表达情况在倒置荧光显微镜下观察荧光,估计慢病毒感染目的细胞的效率对于生长缓慢的细胞,可以适当推迟观察的时间,中途可以传代和换液,以保持细胞良好的生长状态通过细胞感染的效果,确认目的细胞的感染以及是否需要添加MOI Polybreneo对丁因目的基因较大,载体无法携带标志基因的,可以通过定量来检测目的基因的表PCR达来评估感染效率实验体系的放大正式实验时,由于细胞数量较大,所需的病毒用量也需相应增大放大的原则是保持细胞的密度不变,将培养基体积,病毒量按实际细胞数与预实验细胞数的比例放大即使这样,正式实验时由于体系的改变,加上预实验的值设置跨度较大,可进行对MOIMOI的再次优化的设置值为预实验最佳值倍,倍和倍或自己设置合理的数值MOI
0.51L5表病毒感染细胞所用培养基体积和病毒量参考值LMOI=1病毒MOI=10病毒MOI=100病毒正常培养体感染时体积单孔底面积J JJcm21积pl川量(TU)量(TU)量(TU96孔
0.31001001X1041X1041X104板J48孔
0.62002002xl042xl052xl06板24孔
1.95005006xl046xl056xl06板12孔
3.810005002xl056xl066xl07板6孔
9.5200010002xl052xl062xl07板」T2525500025005xl055xl065xl07瓶*表中可培养板底参数数值为公司产品参数CORNING*对于孔面积较小的培养板,由于溶液张力的关系,培养基体积太少会导致病毒的分布不均与,所以不做减半处理。