蛋白真核表达载体的构建方法

蛋白真核表达载体的构建方法实验目的构建真核表达载体，用于蛋白的真核表达实验原理将克隆基因插入合适的载体后导入到真核细胞中用于表达大量蛋白质的方法在蛋白质纯化、定位及功能分析等方面都有应用实验试剂聚合酶、及Tag DNA DNA MarkerDL2000DNA MarkerDL15000；高保真酶；连接酶、、TaKaRa PfuStratagene T4DNA EcoRI BanHI和限制性内切酶Hind IIIFermentas；E.Z.N.A.Gel ExtractionKit Plasmid；抗生素；蛋白豚和酵母提取物Mini KitOmega BBIOXOID o固体培养基低盐在液体培养基中加入琼脂粉，在LB LB

1.5%121℃高压下蒸气灭菌待培养基温度降至左右，加入相应的抗生素20min50℃后，铺制平板，待培养基凝固后，倒放置于保存备用4c液体培养基低盐将胰蛋白陈酵母浸出物LB Tryptone10g,Yeast溶于适量去离子水中，完全溶解后用调Extract5g,NaCl5g,5moi/LNaOH值至定容至在高压下灭菌室温保存pH

7.0〜

7.2,1000mL,121℃20min,氨苇青霉素用灭菌去离子水配成贮存浓度Ampicillin,Amp50mg/mL,分装备用-20℃感受态细胞制备试剂，溶液取溶于

0.1mol/LCaCb27g CaCLFfhO去离子水中并定容至过滤除菌，分装后置保存，用于大肠杆1000mL,-20C菌感受态细胞的制备实验材料凝胶成像及分析系统InGenius BioImaging Gyndene；Zentrifugen离心机美国公司产品；纯净水装置；Rotofix32Hettich ElixlOOMillipore型仪；基石出电泳仪；PTC-200PCR MJReSearchPowerPacTM BIO-RAD型生化培养箱；低温水平离心机；LRH-250n Rotina35R HettichModel550型酶标仪BIO-RAD操作步骤Premix ExTaq25pL

0.5|nL上游引物处＜Fl

200.5pL下游引物模F220|iM

2.5LLI版DNA一目的基因扩增去离子水

21.5|LLI总体积50pL预变性皿；进行个循环,最94℃411194℃30s,55℃30s,72℃35s,30后延伸保存72℃10min,4℃扩增后用琼脂糖凝胶电泳，观察结果1%二产物的回收PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，在长波紫外灯下，用干净刀片将所PCR需回收的条带切下，尽量切除不含的凝胶，得到凝胶体积越小DNADNA越好；然后使用胶回收试剂盒回收产物具体步骤如下:将切DNA PCR1下的凝胶放入离心管，称重记录重量，按照每凝胶加2mL1g入溶胶液对应量，加入适量体积的溶胶液，水浴至凝胶完1mL50〜65全溶解，每隔振荡一次；2〜3min把柱子套在收集管，加入的平衡液，2HiBindDNA2mL500g BL10000rpm离心弃液;1min,将凝胶混合液转移至上述柱子中，离心倒去滤液，3DNA10000rpm1min,若混合液多，可分次上柱，每次转移700iL；加入漂洗液,离心倒去滤液；4600|1L PW10000rpm1min,重复上一步；5上述柱子，离心空柱室温静置是柱子彻底干燥；612000rpm2min,5min,把柱子装在干净的离心管上，加入,室温静置

71.5mL30〜50|iLddH22min,离心洗脱出可重复一次以提高产量12000rpm2min DNA三连接克隆载体参照公司的使用说明书进行连接反应体系Tarkara pMD19-T Vector混匀后，置仪作用以上，保存10pL,PCR16℃4h-20C载体连接反应体系总体积10|dL2xLigase BufferLigationSolution I5LR纯化产物PCR

4.5|nLpMD19-T Vector

0.5pL四连接产物的转化转化用的感受态细胞为大肠杆菌的菌株，具体步骤如下DH5a取感受态细胞置于冰上，轻弹管壁使其混匀；1无菌条件下，匹连接产物加入到四融化的感受态细胞中，轻2550轻混匀，冰上放置30min；混合物于水浴锅中热冲击不要摇动，迅速移至冰上342P60〜90s,放置5min；（）加入培养基，（振荡培养后，摇速4400L LB37245~6001200rpm；R（）将上述菌液均匀涂在含阙平板上，待菌液被平板吸收5100/mL AMP后（约）做好标记，将平板放在＜温箱中倒置培养过夜

0.5h,37

（五）摇菌、挑菌转化后，挑取单克隆，在试管中摇菌后，用菌液法12〜16h5〜8h PCR筛选阳性克隆（）在每个离心管中加入左右的液体培养基（无菌操作）；

11.0mL LB/Amp+）用镶子夹取小枪头在琼脂培养基上挑选阳性白色菌落，菌落要选择适（2当小且圆形的单个菌落；（）把挑有菌落的枪头放进已加入培养基的离心管中；3LB/Amp+（）挑菌后离心管包紧包好，在摇床上摇（或者过夜），保437℃6〜8h4℃存

（六）菌液扩增PCR从固体培养平皿上挑取单克隆菌落，接入到含的液体培养基LB AMPLB中，通过在的摇床上过夜培养，利用反应对菌液进行扩增37℃200rmp PCR反应，菌液反应体系）如表PCR（25L4R总体积（20LLIPremix rTaq

10.2pL上游引物Fl

0.2|nL下游引物

0.2|LF2LI菌液

8.4|dL去离子水预变性进行个循环,最后940c4min；94℃30s,55℃30s,72℃35s,30延伸保存72℃10min,4℃扩增后用琼脂糖凝胶电泳，观察结果与预计的目的片段是否一1%致七阳性菌液测序和序列分析将经鉴定为阳性克隆菌送生物科技有限公司测序XX八摇菌抽质粒参照公司产品说明书进行，具体步骤如下Omega PlasmidMini Kit将带有质粒的接种于抗生素培养液中，摇床培1E.coli5mL LB/37℃养12〜16h；取的菌液,室温下离心收集细菌;

21.0〜

5.0mL10OOOxg1min力口入混和液，漩涡振荡使细胞完全悬浮；3250uL SolutionI/RNaseA往重悬混和液中加入轻轻颠倒混匀次,此操4250uL SolutionII,4-6作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min；加入温和颠倒数次至形成白色絮犬沉淀，5350uL SolutionIII,4离心10000xg10min；转移上清液至套有收集管的结合柱中，室温下62mL HiBindDNA10000xg离心倒去收集管中的滤液；Imin,把柱子重新装回收集管，加入按上述条件离心,弃去滤7500uL HBBuffer,液；把柱子重新装回收集管，加入按上述条件离心，8700uL DNAWash Buffer,弃去滤液；重复步骤一次；98弃去滤液，把柱子重装回收集管，义离心空柱吊以甩干柱101000082111子基质；把柱子装在干净的离心管上，加入

111.5mL30-50uL ElutionBuffer或无菌水到柱子基质中，静置10mM Tris-HCl,pH

8.5l-2min,离心洗脱出lOOOOxg1min DNA

（九）真核表达载体酶切将提取的质粒与载体分别用相应的酶进行双酶切，在反应体系加50^iL入如下组分（可根据需要量适当调整体系及加入量）lOxBuffer5pL载体1fig酶120U/^L1|1L酶220U/pL1|1L去离子水补全至50|1L酶切的温度及时间依据酶的不同而变化，常用温度为37°C

（十）表达载体连接常用的为体系，各加江，目的片段10|nL T4Ligase T4Ligase Buffer1）转化，挑菌，摇菌,液鉴定，抽质粒PCR与载体以比为的比例加入（连接以上保存nmol3/11634h，-20C该部分步骤参照4〜8

（十二）转染（）细胞培养取孔培养板（或用培养皿），向每孔中加入1635mm2含个细胞培养液，培养至mL1〜2x10537℃CCh40%〜60%（）转染液制备在管中制备以下两液（为转染每一个孔细胞所用2EP的量）液用不含血清培养基稀释终量A1-10pig DNA,100HL液用不含血清培养基稀释解脂质体终量轻轻将B2-502000,lOOpL A液加至液中，边加边混匀，室温静置B10-15min（）转染准备用不含血清培养液漂洗两次，再加入不含血清32mL1mL培养液（）转染把复合物缓缓加入培养液中，摇匀，温箱置4A/B37℃6〜24吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养也可直接在原来的培养h,液中加入血清转染后可观察荧光，后可裂解细胞进行验证524h48h WB注意事项脂质体转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响；但一些新型转1染试剂不受血清影响细胞种类、、、和等任何一种细胞均可2COS-7BHK NIH3T3Hela Jurkat作为受体细胞。