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中药降脂复方对新西兰白兔胆二胆汁酸代谢的调节邱冬妮1孙旭I孙思佳毛奇1琦傅晓东2I复旦大学附属华山医院消化内科()1200040复旦大学附属华山医院中医科()2200040【负责与编辑部联系者孙思佳;通讯地址枫林校区西区;手机号码;电子信箱:】本论文受到中医专科培育建设项目(代谢专科傅晓东)资助目的研究中药降脂复方对新西兰白兔胆固醇-胆汁酸代谢的调节机制方法只新西20兰白兔分为中药降脂复方组和对照组,每组只测定两组周后的血清胆固醇水平、血清104总胆汁酸水平、肝脏组织胆固醇7a-羟化酶(CYP7A1)活性及其mRNA、法尼酯衍生物X受体(FXR)的靶基因短异源二聚体伴侣受体(SHP)mRNA和胆盐输出泵(BSEP)mRNA、低密度脂蛋白受体(LDL-R)mRNA表达结果使用中药降脂复方后,兔血清胆固醇水平较对照组下降而血清总胆汁酸水平无明显改变;肝脏活性及其表达较对照组
7.29%,CYP7A1mRNA显著升高(尸<
0.05),FXR靶基因SHPmRNA和BSEPmRNA的表达较对照组显著降低(Pv
0.05),的表达较对照组显著升高(尸<)结论中药降脂复方可能通过减少肠道LDL-RmRNA
0.05胆汁酸的重吸收,抑制肝内(胆汁酸的配体),激活促进肝内胆固醇转化为胆FXR CYP7A1,汁酸,降低血清胆固醇水平关键词胆固醇;胆汁酸;中药降脂复方;法尼酯衍生物X受体;胆固醇7-(1-羟化酶Regulation ofcholesterol bile acid metabolismin NewZealand WhiteRabbits byChinesemedicine JiangzhiCompoundQIU Dongni,SUN Xu,MAO Qiqi,SUN Sijia,FU Xiaodong.Department ofGastroenterology,Huashan Hospital,Fudan University,Shanghai
200040.Department ofChinese Medcine,HuashanHospital,Fudan University,Shanghai200040Corresponding author:Fu Xiaodong,Email:Objective:To studythe regulatorymechanism ofJiangzhi compoundon cholesterolbile acidmetabolismin NewZealand whiterabbits.Methods:Twenty NewZealand whiterabbits weredividedinto twogroups,10in eachgroup.Serum cholesterollevel,serum totalbile acidlevel,liver cholesterol7a-hydroxylase CYP7A1activity and mRNA,short heterodimerchaperone receptorSHP mRNA,bile salt export pumpBSEP mRNAand lowdensity lipoproteinreceptor LDL-R mRNAexpressionin livertissue weremeasured after4weeks.Results:compared withthe controlgroup,the serumcholesterollevel decreasedby
7.29%,while theserum totalbile acidlevel didnot changesignificantly;the activityandmRNAexpression ofCYP7A1in liverwere significantlyincreased P
0.05,theexpression ofSHP mRNAand BSEP mRNA ofFXR targetgenes weresignificantly decreasedP0,05,and theexpression ofLDL-R mRNAwas significantlyincreased P
0.
05.Conclusion:theChinese medicineJiangzhi compoundcan inhibitFXR bileacid ligand,activate CYP7A1,promote theconversionof livercholesterol tobileacidand reduceserum cholesterollevel byreducing intestinalbileacid reabsorption.Key wordsCholestyramine;Cholic Acids;traditional Chinesemedicine lipidloweringcompound;Farnesoid XReceptor;Cholesterol7-alpha-Hydroxylase各类中药降低胆固醇复方制剂在临床上长期使用,获得较好疗效,但药理机制尚不明确20世纪末,法尼酯衍生物受体被发现并证实为肝细胞核内生理性胆汁X farnesoidXreceptor,FXR酸受体川,在胆汁酸/胆固醇代谢和胆汁酸肠肝循环中起重要调节作用胆固醇-羟化酶7a是胆固醇合成胆汁酸途径中的限速酶,是强有力的转录抑制因子⑴短CYP7A1FXR CYP7Al异源二聚体伴侣和胆盐输出泵是short heterodimerpartner,SHP bilesaltexportpump,BSEP FXR正向调节靶基因约的胆汁酸在回肠被主动重吸收入肝脏中药降脂复方可促进胆汁23195%酸从粪便排出,减少回肠胆汁酸重吸收已有研究⑷发现予中药降脂复方后,血清胆固醇水平下降本实验旨在验证中药降脂复方是否通过抑制激活途径而促进胆固醇降解,FXR CYP7A1从而降低血清胆固醇水平材料与方法
一、造模及动物分组清洁级雄性新西兰白兔只复旦大学实验动物中心提供体重单笼饲养,
202.5〜
3.0kg,25℃普通兔粮喂食,每只兔每日总食量约为动物在复旦大学实验动物中心动物房饲养周后,120g1随机分为中药降脂复方组和对照组,每组只中药降脂复方组每天予中药降脂复方中药降10脂复方散袋,南京厚生药业有限公司将中药降脂复方与蒸储水拌匀经胃管5g/lg/kg20ml灌胃周,对照组每天予蒸储水灌胃周420ml4
二、标本采集给药前后分别从兔耳缘静脉空腹采血静置分钟后离心取血清,置入肝功管,2mL30离心后分离出血清,测定血清总胆汁酸和胆固醇水平完成周治疗后处死实验4000r/min5min2动物取肝脏组织切成小块置液氮中速冻并转移至冰箱保存,用于测定、-80C LDL-R mRNA活性及其、和CYP7Al mRNASHP mRNABSEP mRNA
三、实验室分析血清胆固醇水平测定用酶水解法,胆固醇测定试剂盒购自上海名典生物工程有限公司,
1.在型全自动生化分析仪上测定Olympus AU600血清胆汁酸水平测定用酶循环法,全自动胆汁酸测定试剂盒购自日本第一化学药品株
2.式会社,在型全自动生化分析仪上测定OlympusAU
600.肝脏活性测定用酶联免疫吸附法,采用兔胆固醇-羟化酶活性测定试3CYP7Al7a剂盒购自美国公司,在公司通用酶标仪上测定ADL Bio-Tek ELX
800、实时逆转录聚合酶链反应应用试剂公司以一步法抽提3real-time RT-PCR TrizolABI总RNA;对RNA行逆转录;SYBRGreen PCR试齐I」盒达辉生物进行PCR扩增,用定量仪公司检测各基因引物序列见表反应体系为似,ABIPRISM®7300PCR ABI1,PCR50以作为内参照数据采用定量仪自带软件分析GAPDH PCRABI Prism7300SDS表各基因引物序列1基因引物序列SHP正义反义5-tggcccaagacatggtgac-35-gctcctccagcaggatcttct-3BSEP正义
5、CAACGCATTGCTATTGCTCG3反义GTTCTGG ATGGTGGAC A AA-39CYP7A1正义5,_aggagaaggcgaatgggtgo3反义5-gcacagcccagatatggaatc-3正义」5GCCCACCGAGGAGTTCA TLDL-R反义」5GGCCCTGGTGAGGTTTGAT TGAPDH正义S-CCG AGGGCCCACTA AAGG-31反义5-GCTGTTG AAGTC AC AGG AGACAA-3f
三、统计学分析应用统计软件包,数据以均数土标准差壮表示,行非配对,检验,为差SPSS
10.0S PV
0.05异有统计学意义结果
一、胆汁酸和胆固醇水平两组白兔在中药降脂复方治疗过程中均未出现腹泻或便秘周后,中药降脂复方组和对照组血清总胆固醇水平分别为和
43.05±
0.06mmol/L
3.29±
0.11中药降脂复方组较对照组下降mmol/L,
7.29%P
0.05中药降脂复方组血清胆汁酸水平为对照组为组间差
7.19±
0.261moi/L,
7.23±
0.35pnol/L,1异无统计学意义说明两组血清胆汁酸水平相同P
0.05,
二、肝脏组织活性及其表达CYP7Al mRNA周后,中药降脂复方组和对照组肝脏组织活性分别为和4CYP7Al
1.296±
0.211ug/ml中药降脂复方组较对照组升高实时亦显示治疗组
0.799±
0.098ug/ml P
0.05,62%RT-PCR肝脏组织的表达较对照组显著升高见表相对值为对照组的倍CYP7A1mRNA2,
3.46
三、肝脏组织和的表达SHPmRNA BSEPmRNA周后,实时显示,治疗组靶基因和的表达较对照4RT-PCR FXRSHPmRNA BSEPmRNA组显著降低,的相对值较对照组下降的相对值较对照组下降SHPmRNA43%,BSEPmRNA48%(见表)提示肝脏组织活性受到抑制2,FXR
四、肝脏组织的表达LDL-R mRNA周后,实时显示,中药降脂复方组的表达较对照组显著升高,4RT-PCR LDL-R LDL-R mRNA的相对值为对照组的倍(见表)
2.22表中药降脂复方组和对照组各指标实时相对值2RT-PCR组另IJ例CYP7A1SHPmRNA BSEPmRNA LDL-R数mRNA mRNA中药降脂复
105.23±
0.79*
5.03±
0.02*
3.71±
0.14*
13.03±
0.35*方组对照组
101.51±
0.
238.87±
0.
457.11±
0.
265.91±
0.11*与对照组比较,P
0.01讨论胆汁酸肠肝循环是维持体内胆汁酸池内稳态的重要环节,也是调节胆汁酸合成速率的重要机制合成胆汁酸是胆固醇降解的主要通路,约的胆固醇在肝细胞内经限速酶经50%CYP7Al典途径合成初级胆汁酸,由泵入胆小管进入胆囊,再分泌入小肠,在肠菌的作用下转化BSEP为次级胆汁酸,在回肠被回肠刷状缘钠依赖性胆汁酸转运体(ASBT)主动重吸收入小肠黏膜细胞,与胆汁酸结合蛋白(IBABP)结合后经门静脉进入肝脏,再经BSEP泵入胆囊,形成胆汁分泌肠道中的胆汁酸被重吸收,随粪便排出,这部分丢失的胆汁酸由肝内胆固醇95%5%合成胆汁酸来补充,这就是经典的胆汁酸肠肝循环⑸,也是体内胆固醇降解的重要途径定位于哺乳动物的肝细胞核内,作为核胆汁酸受体,被回流入肝脏的胆汁酸激活,直FXR接参与多种胆汁酸/胆固醇代谢和胆汁酸肠肝循环相关基因的转录调控,已知的主要靶基因包括、、、等⑹是正向调节靶基因,被激活后,诱导CYP7A1SHP BSEPIBABP SHPFXR FXR转录,继而使肝受体同源物(的重要转录调节因子)失活,从而抑制SHP-1LRH-l,CYP7Al转录⑵CYP7Al中药降脂复方促进粪便排泄,影响胆汁酸在回肠的重吸收本实验结果表明,白兔回流入肝脏的胆汁酸(FXR激动性配体)大大减少,导致FXR失活,这一点可由肝脏组织中FXR靶基因和的表达较对照组显著降低表现出来是强有力的SHP mRNABSEPmRNAFXR CYP7Al转录抑制因子;失活后,对的抑制作用被解除故本实验中中药降脂复方组肝脏FXR CYP7Al组织的表达较对照组显著升高,活性亦升高,从而使肝脏胆汁酸合成CYP7Al mRNACYP7Al增加肝细胞表面受体,是清除循环的主要途径,其合成速率与细胞内胆固醇含量LDL LDL呈负相关本实验结果表明,中药降脂复方组的表达较对照组显著升高,说明增加的LDL-R胆汁酸合成消耗了肝细胞内胆固醇,激活肝脏受体,肝脏从循环中摄取胆固醇增加,从LDL而使血清胆固醇水平下降⑺因此可以认为中药降脂复方降低血清胆固醇水平的机制为通过抑制继而激活刺激胆固醇转化为胆汁酸除中药降脂复方外,已有报道考来烯胺、FXR,CYP7Al回肠抑制剂也可激活降低血清胆固醇水平,其机制也是促进胆固醇降ASBT SC—435CYP7A1,解和胆汁酸合成网本实验应用中药降脂复方后,尽管回肠胆汁酸重吸收显著减少,回流入肝脏的胆汁酸相应减少,但中药降脂复方组血清胆汁酸水平与对照组相比却无明显变化我们认为,虽然经肠道重吸收的胆汁酸减少,但肝内由胆固醇合成胆汁酸增多,弥补了由肠道丢失的胆汁酸,使胆汁酸肠肝循环建立新的平衡,保持了体内总胆汁酸池大小不变类似由胆汁酸重吸收障碍激活肝脏胆汁酸合成,从而降低血清胆固醇水平的情况可见于回肠切除患者191综上所述,回流入肝脏的胆汁酸能激活从而调节肝内的活性和胆固醇的降FXR,CYP7Al解中药降脂复方能减少回流入肝脏的胆汁酸,使肝脏失活,继而解除对转录的FXR CYP7Al抑制,促进肝内胆固醇的降解和胆汁酸合成在体内胆汁酸池维持平衡的同时,消耗了肝内及循环中的胆固醇,使血清胆固醇水平下降参考文献1Hai Li,Guorong Xu,Quan Shang,et al.Inhibition ofIleal Bile Acid TransportLowers PlasmaCholesterolLevels byInactivating HepaticFarnesoid XReceptor andStimulating Cholesterol7alpha-Hydroxylase.Metabolism,2004,537:927-
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72.。