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产品编码取GF-001GF GeneFunbio产品名称高效蛋白裂解液()HP™HP IXhigh performance晶凡(上海)生物技术公司出品的高效蛋白裂解液是一种高效的细胞组HP™织总蛋白抽提缓冲液随裂解液同时配送蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(倍稀100释使用)该裂解液对于抽提细胞核蛋白和多次跨膜蛋白具有极好的效果,该裂解液裂解得到的蛋白样品可以兼容等定量方法,主要用于常规的BCA Westernblot分析,含磷酸化蛋白等(参考文献)对于实验,我们将提供专门的针对细1-7IP胞膜蛋白、细胞核蛋白和胞浆蛋白的抽提试剂和解决方案保存条件该裂解液中未添加叠氮钠等防腐剂,保存半年内有效也可以分装保存,一4c-20℃年有效蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂需放置保存-20C注意事项为取得最佳的使用效果,蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂尽量避免过多的反复冻融
1.可以适当分装后使用考虑到使用方便,我们已经分装成小份(一只)lOOuL裂解样品的所有步骤都需在冰上或进行
2.4c为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作
3.使用说明对于培养细胞样品取出高效蛋白裂解液,轻轻混匀,避免大幅度摇晃;如果是分装样品,室
1.HPTM温溶解,混匀取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(倍稀释)例如毫升高效蛋白裂解液各加微升10010HP™100的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂置冰上备用对于贴壁细胞去除培养液,用、生理盐水或无血清培养液快速冲洗遍
2.PBS2-3(如果血清中的蛋白没有干扰,可以不洗)按照孔板每孔加入微升6150-250裂解液的比例(有些时候,处理的条件要求细胞密度低,可以调整为微升,80下同;或者换成毫米的皿)加入裂解液慢慢晃动培养皿或板,使裂解60/100液和细胞充分接触(观察到液体流过整个皿底)通常裂解液接触细胞秒1-2后,细胞就会被裂解通常室温低于度时,裂解过程可以不必放冰上,整25个过程控制在分钟可以置于摇床上轻摇,裂解分钟1010对于悬浮细胞离心收集细胞,用手指把细胞用力弹散用、生理盐水或
3.PBS无血清培养液洗涤次,离心收集细胞,吸干或空干液体,注意不要使细胞随2液体流失(动作要领为倒液体时要连续性,不要折返回来)按照孔板每孔6细胞加入微升裂解液的比例加入裂解液再用手指轻弹以充分裂解细150-250胞充分裂解后应没有明显的细胞沉淀如果细胞量较多,必需分装成50-100万细胞/管,然后再裂解分钟
10.将裂解物收集到离心管,超声个秒超声处理可以促进蛋白溶解和剪切核425酸,尤其是对于膜蛋白的抽提很必要没有超声仪器的,可以改用皮试针头吸打几次也会达到效果充分裂解后,离心分钟,取上清,即可进行后续的定量、
5.12000-15000g10BCA、等操作定量蛋白浓度大约为微克每毫升PAGE Westernblot BCA3000-
5000.,抽取定量样品后的上清样品加体积的沸水浴6BCA1/23x SDSloading buffer,煮分钟,冰上放置数分钟后保存3-5-20C裂解液用量说明通常孔板每孔细胞加入微升裂解液已经足够,但如果细胞6150密度非常高可以适当加大裂解液的用量到微升或微升按照不同细胞密度、200250不同细胞类型进行微调对于组织样品取出高效蛋白裂解液,轻轻混匀,避免大幅度摇晃;如果是分装样品,
1.HPTM室温溶解,混匀取适当量的裂解液,在使用前数分钟内加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂(倍稀释)例如毫升高效蛋白裂解液10010HP™各加微升的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂置冰上100冰冻组织快速取出称重这时候最好是放在或毫升离心管,便于下面的
2.25组织剪碎对于脑组织等不需要剪碎的样品组织,可以直接放到玻璃匀浆器里按照每毫克组织加入毫升裂解液的比例(湿重组织的)快速
3.1001-21:10-20加入裂解液如果需要高浓度的蛋白样品,可以适当减少裂解液的用量把组织剪切成细小的碎片
4.用电动或玻璃匀浆器匀浆,直至充分裂解对于脑组织来说,玻璃匀浆器通
5.常上下次即可注意温度,如果室温超过度时,可以在冰上插管10-2025用电动匀浆器或在玻璃匀浆器套管中加入碎冰匀浆后马上吸取液体到离心管,插冰上放置分钟中间每隔分钟混匀一下这期间可以10-153-5进行下一步的超声处理将裂解物收集到离心管后,可以马上超声个超声处理可以促进蛋白
6.25s溶解和剪切核酸,尤其是对于膜蛋白的抽提很必要没有超声仪器的,可以改用毫升枪头反复吸打多次也会达到效果1充分裂解后,离心分钟,取上清,即可进行后续的定
7.12000-15000g10BCA量、、等操作PAGE WesternBlot如果组织样品本身非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液裂解,通过强
8.烈使样品裂解充分然后同样离心取上清,用于后续实验直接裂vortex解的优点是比较方便,不必使用匀浆器,缺点是没有使用匀浆器那样裂解得比较充分抽取定量样品后的上清样品加体积的沸水浴
9.BCA1/23x SDSloading buffer,煮分钟,冰上放置数分钟后保存3-5-20℃注如果没有使用超声步骤,裂解产物中有时候可能会出现一小团透明胶状物,属正常现象该透明胶状物为含有基因组等的复合物在不检测和基因DNA组结合特别紧密的蛋白的情况下,可以直接离心取上清用于后续实验;DNA如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白,则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物,随后离心取上清用于后续实验如果检测一些常见的转录因子,例如、等时,通常不必进行超声处理,就可以检测到这些转录NF-kappaB p53因子参考文献
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