革兰氏染色法

、革兰氏染色法n

一、实验原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌G+和革兰氏阴性菌G两大类，是细菌学上最常用的鉴别性染色法革兰氏染色法的主要步骤是先用结晶紫进行初染；再加媒染剂一碘液，以增加染料与细胞间的亲和力，使结晶紫和碘在细胞膜上形成分子量较大的复合物；然后用脱色剂乙醇或丙酮脱色；最后用蕃红复染凡细菌不被脱色而保留初染剂的颜色紫色者为革兰氏阳性菌，如被脱色后又染上复染剂的颜色红色者为革兰氏阴性菌该染色法所以能将细菌分为G+菌和G菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的G「菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色

二、实验器材

1、菌种牛肉膏琼脂斜面28℃培养24h的大肠杆菌Escherichia coli斜面菌种，牛肉膏琼脂斜面28℃培养16h的枯草杆菌Bacillus subtilis斜面菌种；

2、仪器显微镜；

3、材料载玻片，香柏油，二甲苯，擦镜纸，吸水纸，染色缸等

4、染料草酸镂结晶紫染色液，路哥氏Lugol碘液，95%乙醇，

0.5%番红染色液；

三、操作步骤

1、涂片在一张载玻片上加两滴蒸储水后，分别涂布枯草芽抱杆菌和大肠杆菌注意涂片切不可过于浓厚

2、固定将制成的涂片干燥固定，固定时通过火焰-2次即可，不可过热，以载玻片不烫手为宜

3、染色⑴初染将玻片置于玻片搁架上，加草酸镂结晶紫染色液加量以盖满菌膜为度，染色1-2min倾去染色液，用自来水小心地冲洗⑵媒染滴加Lugol碘液,染1-2min,水洗⑶脱色滴加95%乙醇，脱色20-25s立即水洗，以终止脱色⑷复染滴加蕃红，染色2-3min,水洗最后用吸水纸轻轻吸干

4、镜检干燥后，置油镜观察被染成紫色者即为革兰氏阳性菌G+；被染成红色者是革兰氏阴性菌G.

四、注意事项

1、革兰氏染色成败的关键是脱色时间如脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而被误认为是革兰氏阴性菌；如脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被认为是革兰氏阳性菌脱色时间的长短还受涂片厚薄、脱色时玻片晃动的快慢及乙醇用量多少等因素的影响，难以严格规定一般可用已知革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌作练习，以掌握脱色时间当要确证一个未知菌的革兰氏反应时，应同时做一张已知革兰氏阳性菌和阴性菌的混合涂片，以资对照

2、染色过程中勿使染色液干涸用水冲洗后，应吸去玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果

3、选用培养16-24h菌龄的细菌为宜若菌龄太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应实验四培养基的制备和灭菌、培养基的制备I

一、实验原理培养基是按照微生物生长发育的需要，用不同组分的营养物质调制而成的营养基质人工制备培养基的目的，在于给微生物创造一个良好的营养条件把一定的培养基放入一定的器皿中，就提供了人工繁殖微生物的环境和场所自然界中，微生物种类繁多，由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究上的目的不同，所以培养基在组成原料上也各有差异但是，不同种类和不同组成的培养基中，均应含有满足微生物生长发育的水分、碳源、氮源、无机盐和生长素以及某些特需的微量元素等此外，培养基还应具有适宜的酸碱度（pH值）和一定缓冲能力及一定的氧化还原电位和合适的渗透压根据制备培养基对所选用的营养物质的来源，可将培养基分为天然培养基、半合成培养基和合成培养基三类按照培养基的形态可将培养基分为液体培养基和固体培养基根据培养基使用目的，可将培养基分为选择培养基、加富培养基及鉴别培养基等培养基的类型和种类是多种多样的，必须根据不同的微生物和不同的目的进行选择配制，本实验分别配制常用培养细菌、放线菌和真菌的牛肉膏蛋白陈培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基等固体培养基固体培养基是在液体培养基中添加凝固剂制成的，常用的凝固剂有琼脂、明胶和硅酸钠，其中以琼脂最为常用，其主要成份为多糖类物质，性质较稳定，一般微生物不能分解，故用凝固剂而不致引起化学成份变化琼脂在95℃的热水中才开始融化，融化后的琼脂冷却到45℃才重新凝固因此用琼脂制成的固体培养基在一般微生物的培养温度范围内（25C-37C）不会融化而保持固体状态

二、实验器材

1、药品琼脂，INNaOH溶液，1NHC1溶液，牛肉膏蛋白陈培养基、高氏一号合成培养基和马铃薯蔗糖培养基的配方药品；

2、材料具刻度1000毫升塘瓷盅或小铝锅，天平，10X200mm试管，量筒，小烧杯，玻璃棒，骨匙，pH试纸，分装漏斗，试管盒，纱布，棉花，报纸，麻绳,标签

三、操作步骤

1、计算称量根据配方，计算出实验中各种药品所需要的量，然后分别称（量）取

2、溶解一船情况下，几种药品可一起倒入烧杯内、先加入少于所需要的总体积水进行加热溶解（但在配制化学成分较多的培养基时，有些药品，如磷酸盐和钙盐、镁盐等混在一起容易产生结块、沉淀，故宜按配方依次溶解个别成分如能分别溶解，经分开灭菌后混合，则效果更为理想）加热溶解时，要不断搅拌如有琼脂在内，更应注意待完全溶解后，补足水分到需要的总体积

3、调节pH用滴管逐滴加入IN NaOH或IN HC1边搅动；边用精密的pH试纸测其pH值，直到符合要求时为止pH值也可用pH计来测定

4、过滤要趁热用四层纱布过滤A.培养基的分装B.棉塞的做法

1.正确

2.管内太短，外部太松

3.整个棉塞太松

4.管内太紧，外部太短松图VT培养基的分装装置与棉塞

5、分装按照实验要求进行分装装入试管中的量不宜超过试管高度的1/5,装入三角烧瓶中的量以烧瓶总体积的一半为限在分装过程中，应注意勿使培养基沾污管口或瓶口、以免弄湿棉塞，造成污染

6、加塞培养基分装好以后，在试管口或烧瓶口上应加上一只棉塞棉塞的作用有二一方面阻止外界微生物进入培养基内，防止由此而引起的污染；另一方面保证有良好的通气性能，使微生物能不断地获得无菌空气因此棉塞质量的好坏对实验的结果有很大影响

7、灭菌在塞上棉塞的容器外面再包一层牛皮纸，便可进行灭菌培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损坏培养基的必要成分如果分装的斜面，要趁热摆放并使斜面长度适当（为试管长度1/3-1/2,不能超过1/2）培养基经灭菌后，应保温培养2-3天，检查灭菌效果,无菌生长者方可使用

四、注意事项

1、配制固体培养基用的琼脂应先行用冷水浸泡，纱布过滤，在调好pH值后加入

2、配制高氏一号合成培养基时应小心溶解淀粉，不要成团、微生物的接种方法IV

一、实验原理微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等本次实验做斜面接种技术

二、实验器材

1、菌种枯草芽抱杆菌，大肠杆菌；

2、培养基牛肉膏蛋白陈试管斜面培养基；

3、材料接种环，酒精灯

三、操作步骤斜面接种技术具体操作如下

1、贴标签接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等贴在距试管口径2-3厘米的位置

2、点燃酒精灯

3、接种用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上无菌操作程序（图V-5）简述如下⑴手持试管将菌种和待接斜面的两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间部位斜面向上，并使它们位于水平位置（图V-5a）⑵旋松棉塞先用右手将棉塞旋松，以便接种时拔出⑶取接种环右手拿接种环（如握钢笔一样）、在火焰上将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌⑷拔棉塞用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出菌种管和待接试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌（切勿烧得过烫），如图V-5b、C所示⑸环冷却将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却⑹取菌种待环冷却后轻轻沾取少量菌或袍子，然后将接种环移出接种管,如图V-5d所示，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰图V-5斜面接种时的无菌操作⑺接种在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管从斜面培养基的底部向上部作“Z”形来回密集划线，勿划破培养基（图V-5e）有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央拉一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点⑻塞棉塞取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时纳入不洁空气，如图V-5f、g所示⑼环灭菌将接种环烧红灭菌放下接种环，再将棉花塞旋紧，如图V-5h所示。