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柱纯化蛋白原理qQ柱属于离子交换柱层析技术的一种,常用于蛋白质纯化中本文将详细介绍Q柱纯化蛋白的原理及操作步骤
一、原理Q柱的交换基质是一种具有阳离子交换能力的离子交换树脂蛋白质在缓冲液中带有正电荷或负电荷,与Q柱的阴离子或阳离子交换基团发生静电吸附,从而被分离出来通常在pH
7.5-
8.5的缓冲液中进行Q柱层析,pH值的选择需要考虑到目标蛋白的等电点(pl),使其保持带电状态如果蛋白质的pl小于pH
8.5,则会以负电的形式存在,可以使用弱阳离子交换柱;如果蛋白质的pl大于pH
7.5,则会以正电的形式存在,可以使用弱阴离子交换柱如果目标蛋白的pl与pH
7.5-
8.5之间,则可以使用强阳离子交换柱或强阴离子交换柱
二、操作步骤
1、样品的制备准备待纯化的蛋白质样品,除掉悬浮物和泡沫,并且将样品预冷至4℃
2、Q柱的操作在打开柱子前,应先在柱子底部放置一些石英砂或氧化铝,以防止样品浆湖压缩柱层将Q柱装入柱架中,并且在顶部加入过滤器床用缓冲液进行柱子均相化,并清洗柱子用样品缓冲液进行柱子均相化,以引起静电吸附,加强分离效果
3、样品装载将待纯化的样品通过
0.45微米滤膜过滤并将样品缓冲液加入适量的离心管中将离心管中的样品缓冲液均匀地加入Q柱柱床中,稳定将样品加入柱子中
4、洗脱柱样品被平衡后,用缓冲液进行柱子冲洗,使不结合于柱子的蛋白质被彻底清除清洗完成之后,将柱子中的目标蛋白缓慢洗脱,收集洗脱液进行后续的纯化或分析
三、注意事项
1、准备充分的缓冲液和清洗液,以保证连续的流动和优质分离
2、使用过滤器床过滤样品和洗脱液,以防止样品中的悬浮物阻塞柱床
3、控制洗脱流量,避免过快或过慢,流速一般为柱床高度的1-2倍
4、根据样品的性质和Q柱的性质选择不同的缓冲液和pH值
5、必要时使用其他层析技术进行单步纯化
四、结论在蛋白纯化中,Q柱是值得信赖的一种层析技术,适用于小至几kDa的小分子到几百kDa的大分子蛋白质的分离关键是准确选择充填物和缓冲液,根据样品和柱子的不同特性进行正确的操作。