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附件9体外皮肤变态反应人细胞系活化试验In VitroSkin SensitisationHuman CellLine ActivationTest h-CLAT范围1本方法规定了体外皮肤变态反应人细胞系活化试验的基本原则、要求和方法本方法适用于可溶或者能形成稳定分散体系的化妆品用化学原料安全性毒理学检测试验目的2预测和评价化妆品用化学原料是否具有潜在皮肤致敏性定义3细胞存活率浓度值
3.175%75%cell viability用受试物染毒后,细胞存活率为时对应的受试物浓度值75%荧光强度均值
3.2Mean FluorescenceIntensity用流式细胞仪测定的荧光强度几何平均数相对荧光强度值
3.3Relative FluorescenceIntensity扣除同型对照后,倍的受试物和溶剂对照的比值100MFI MFI有效作用浓度值
3.4CD86Effective Concentration150的相对荧光强度值达到时对应的受试物浓度值CD86150有效作用浓度值
3.5CD54Effective Concentration200的相对荧光强度值达到时对应的受试物浓度值CD54200试验原理4当致敏物接触皮肤后,树突状细胞在移动到淋巴器官的过程中分化成熟,并上调一系列表面分子的表达体外培养类树突状细胞人急性单核白血病细胞,并和受试物共暴露后,使24h用荧光抗体染料对细胞表面分子、染色并用流式细胞仪测定,从而判定待测物是否CD86CD54具有致敏性试验方法5试验材料与试剂
5.1细胞
5.
1.1选用人急性单核白血病细胞要求来源The humanmonocytic leukaemiacell line,THP-1清晰,代数明确代细胞使用前应进行稳定性检测,通过稳定性检测后可用于本试验30培养基
5.
1.2基础培养液中加入的侯筑基乙醇、胎牛血清、青霉素和
16400.05mM10%100units/mL00链霉素,配制成完全培养基|ig/mL1640磷酸盐缓冲液
5.
1.3PBS氯化钠、七水磷酸氢二钠、无水磷酸二氢钾去离子水定容至调
9.00g
0.73g
0.21g,1000mL,高压灭菌pH=
7.2〜
7.4,染色缓冲液
5.
1.4溶液中加入的牛血清白蛋白PBS
0.1%m/v染料和抗体类物质
5.
1.5氨基放线素菌染料7--D7-AAD标记的小鼠单克隆抗体FITC CD86FITC-CD86标记的小鼠单克隆抗体PE CD54PE-CD54标记的小鼠FITC IgGlFITC-IgGl标记的小鼠PE IgG1PE-IgGl段受体阻断剂Fc Fc-Blocker受试物储备液
5.
1.6于实验前一天准备用生理盐水或完全培养基配制的受试物溶液,倍倍1640100mg/mL2比稀释,得到个浓度点的储备液系列不能溶解于上述溶剂的物质选用作为溶剂,配8DMSO制浓度受试物溶液,倍倍比稀释配制得至个浓度点的储备液系列500mg/mL2U8受试物工作液
5.
1.7实验当天,溶于完全培养基或生理盐水的受试物储备液系列依次用完全培养16401640基稀释倍得到工作液溶于的受试物储备液系列依次用完全培养基或生理盐水50DMSO1640稀释倍得到工作液将工作液等体积加入细胞悬液中进行染毒,所以最终细胞接触浓度是250工作液浓度再稀释倍如果以上浓度无法测得受试物的细胞存活率浓度值275%75%cell可以进行浓度调整但溶解于生理盐水或完全培养基的受试物最终细胞接viability,CV75,1640触浓度最高不超过5mg/mL;溶解于DMSO的受试物最终细胞接触浓度最高不超过1mg/mL,最终接触浓度不得超过DMSO
0.2%溶剂选择
5.
1.8选用、完全培养基或者生理盐水作为溶剂在证明溶剂不影响测试结果的情况DMSO1640下,可使用除生理盐水,培养基,以外的其他溶剂DMSO阳性对照
5.
1.9选用2,4-二硝基氯苯DNCB,CAS97-00-7,99%作为阳性对照根据细胞75%存活率情况确定阳性对照浓度阴性对照
5.
1.10选用乳酸LA,CAS50-21-5,85%作为阴性对照根据细胞75%存活率情况确定阴性对照浓度试验步骤
5.2细胞培养
5.
2.1悬浮细胞使用完全培养基,于℃、培养箱内培养,倒置显微镜下观THP-11640375%CO2察细胞状态细胞复苏周并通过稳定性检测后可开展试验细胞最大培养浓度不宜超过21x106个复苏后培养时间不超过个月,传代次数不超过次/mL,230细胞稳定性检测
5.
2.2细胞复苏2周后,选用2,4-二硝基氯苯DNCB,CAS97-00-7,299%和硫酸银NiSCU,CAS10101-97-0,99%作为阳性检测物,乳酸LA,CAS50-21-5,85%作为阴性检测物当细胞的和分子对和均产生阳性表达,细胞的和分子对均产CD86CD54DNCB NiSCUCD86CD54LA生阴性表达,视为细胞通过稳定性检测农度确认523CV757细胞以个的密度于细胞培养箱内培养后,离心加入新鲜2x105/mL48h4℃,300xg5min的完全培养基调节细胞密度至个吸取细胞悬液和受试物工作液混2x106/mJ500|1L500/L1:1合接种于孔板上将孔板放置于细胞培养箱内染毒后,转移至离心管中,242424h
1.5mL4℃离心收集细胞并加入染色缓冲液清洗次,清洗后加入染色液于室温下染5min,1mL27-AAD色如台盼蓝或其他经过证明能够提供相似结果的细胞毒性染料,也可用于细胞存活lOmin PI,率检测染色完成后用染色缓冲液离心清洗细胞次,最终加入匹染色缓冲液重悬细胞,移1mL2500入流式管上机测定流式细胞仪一次进样累计收集个活细胞根据流式细胞仪给出的活细胞占总细胞的10000百分比,得到受试物个不同浓度下的细胞存活率,用如下公式计算出细胞的值8CV7575—c xLogb—75-a xLogdLogCV75=a-ca超过75%的最低细胞存活率%ba对应的受试物浓度pg/mLc未超过75%的最高细胞存活率%dc对应的受试物浓度pg/mL、表达检测
5.
2.4CD86CD54根据已经测得的值配制、表达检测的受试物工作液浓度将最终细胞接CV75CD86CD54触浓度值最高设置为依次倍稀释得到个工作液浓度系列如果受试物不具有细L2XCV75,L28胞毒性,则最终细胞接触浓度最高设置为溶解于完全培养基或生理盐水或5mg/mL1640(溶解于)空白对照为完全培养基,溶剂对照为受试物溶剂,阳性对照Img/mL DMSO1640为或其他可在本试验中稳定表达的致敏物DNCB以个的初始密度培养后,离心调节细胞密度至个取匹细胞悬2x105/mL2d2x106/mL500液和匹受试物工作液混合接种于孔板上每次、表达检测试验均设置一5001:124CD86CD54个空白对照、一个溶剂对照和一个阳性对照(当使用培养基或生理盐水作为溶剂时、溶1640剂对照与空白对照相同)将孔板放置细胞培养箱内染毒后转移到离心管,用2424h
1.5mL染色缓冲液清洗细胞次后,加入人受体阻断剂对细胞段抗体进行封闭、加入1mL2Fc Fc7-AAD染色液对死细胞染色染色和封闭完成后,用染色缓冲液清洗细胞次后进行抗体染色将每管细胞平均分为两2份,一份作为试验组,加入和加染色缓冲液至染色体系;另一份FITC-CD86PE-CD54,50pL作为同型对照组,加入FITC-IgGl和PE-IgGl,加染色缓冲液至50(1L染色体系(染料具体用量可根据所购染料性质和实验室情况确定,推荐用量为的和的加染色缓冲液6pL FITC1|1L PE至染色体系)两组细胞加入染料后轻轻吹打几次使染色均匀,、避光染色50pL4℃30mino其他荧光染料标记的和抗体如经证明,能够提供与、偶联抗体类似的结CD86CD54FITC PE果(如通过附件的参考物质验证),也可用于、表达检测1CD86CD54染色完成后加入染色缓冲液清洗次最终用染色缓冲液重悬细胞,移至流式管中2500pL待用用流式细胞仪对每组细胞的FITC、PE、7-AAD染料的荧光强度均值(MeanFluorescenceIntensity,MFI)进行测定用如下公式计算出受试物的相对荧光强度值(RelativeFluorescence)Intensity,RFT(受试组一受试组同型对照)MFI MFIxlOORFI=溶剂对照组一溶剂对照组同型对照MFI MFI流式细胞仪
5.
2.5正式测定前应用空白细胞和每种染料的单染细胞调节流式细胞仪的电压和补偿,确保消除不同测试通道间的相互干扰调试好测定条件后,每次实验累计收集个活细胞,当细胞10000存活率低导致活细胞数量不足时,至少累计收集个细胞30000结果判定标准6致敏性结果判定
6.1每种受试物至少进行两次独立的、表达检测试验每次表达检测试验,在细胞CD86CD54存活率大于的前提下,如果有任一浓度下的受试物则该次表达判定50%RFICD86N150,CD86为阳性;如果有则该次表达判定为阳性两次试验中和任一RFICD54N200,CD54CD86CD54指标两次判定为阳性则判定该物质具有致敏性如果两次试验和的表达均不具有CD86CD54一致性,则进行第三次试验若第三次试验中和表达均为阴性,判定为非致敏物,CD86CD54否则判定该物质具有致敏性有效作用浓度计算
6.2对于判定为具有致敏性的物质,可以进一步计算其有效作用浓度值(EffectiveConcentration,EC)EC值是能引起阳性表达的最低作用浓度,在形成整合策略(IATA)时有助于预测致敏效力当所测浓度范围内既有又有时,计算的有效作用浓度RFICD862150RFICD86V150CD86值,公式如下EC150150-RFIBxCA-CBEC15OCB+RFIA-RFIB当所测浓度范围内既有又有时,计算的的有效作RFICD54N200RFICD54200CD54RFI200-RFIBxCA-CBEC200=CB+用浓度值公式如下EC200,RFIA-RFIBRFIARFI150EC150或N200EC200的最低RFI值RFIBRFK150EC150或200EC200的最高RFI值对应的受试物浓度CA|ig/mL RFIA对应的受试物浓度CB pig/mL RFIB若所测浓度范围内RFI CD86均150,选用如下公式计算EC
150、EC150=2A[log2CB+0RF[Bw0g2CAiog2CB]Lb7RFIA-RFIB若所测浓度范围内RFICD54均200CD54,选用如下公式计算EC200EC200=2A[log2CB4-200-RFIBX-g2CAT0g2CB]」L b\RFIA-RFIBRFIBRFI150EC150或200EC200的最低RFI值RFIA比RFIB大至少10的最低RFI值对应的受试物浓度CA|ig/mL RFIA对应的受试物浓度CB|ig/mL RFIB三次独立平行试验中计算平均值,作为和的最终值;两次独立平行试验中选EC150EC200取较大的值作为和的最终值EC150EC200试验成立条件
6.
36.
3.1溶剂对照的细胞存活率大于90%;溶剂对照的RFICD
86、RFICD54均不可以达到阳性标准;
6.
3.2所有空白对照及溶剂对照的MFI值与其相对应的同型对照MFI值的比值应当大于105%;
6.
3.3阳性对照需要满足RFICD86150且RFICD54N200,同时所对应的细胞存活率大于50%;每次独立试验至少有一半以上的受试物浓度对应的细胞存活率大于否则应重新测
6.
3.450%,定值;CV75如果受试物出现阴性结果,受试物最高浓度值所对应的细胞存活率应低于除非受
6.
3.590%试物最高浓度值已经为本试验可接受的最大浓度或该受试物能达到的最大溶解度,这种情况下即便最高受试物浓度对应的细胞存活率高于仍然接受阴性结果90%,结果解释7本方法要求受试物具有可溶性,对正辛醇-水分配系数(LogKow)
3.5的化学品,易出现假阴性的结果,需采用其他试验进一步确证受试物的致敏性由于缺乏机体代谢过程,本方法不适用于对前抗原(即需要通过酶活化的物质)和半抗原(即需要通过氧化活化的物质)物质的致敏性检测本方法模拟皮肤致敏有害结局路径()的Adverse OutcomePathway,AOP关键事件3树突状细胞活化过程,可为体外皮肤变态反应的整合测试和评估方法(IATA)提供备选方法。