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附件15体内彗星试验In VivoMammalian AlkalineComet Assay范围1本规范确定了体内彗星试验的基本原则、要求和方法本规范适用于化妆品原料的遗传毒性检测试验目的2评价化妆品用原料的遗传毒性定义3碱性单细胞凝胶电泳在单个细胞或细胞核水平检测损伤的一种敏感技术
3.1DNA彗星经过电泳后细胞核的形状,形似彗星细胞核部分形成彗星头部,在电场力的作用
3.2下脱离细胞核的片断形成彗尾DNA“刺猬状”细胞显微图像下由小或模糊不清的头以及大的弥漫性尾组成的细胞
3.3尾部含量反应总强度(彗头与彗尾之和)中彗星的强度可反应片断的数
3.4DNA DNA量,用百分比表示最大耐受剂量试验期内引起动物产生轻微毒性效应的最高剂量,在这个剂量下,动物产
3.5生明显的临床体征,如异常行为或反应,轻微的体重下降或靶组织细胞毒性,但是并不会引起死亡或痛苦试验原理4双螺旋结构在强碱性溶液中()会松弛,在电场力的作用下,正常的保DNA pH13DNA留在原位不动,而单链或双链断裂所形成的片断在会向阳极移动,形成彗星状DNA DNA片断所形成的彗星状拖尾的长度及强度可以反应片断的大小和数量通过检测尾部DNA DNA含量(%)等终点指标可以评价损伤程度DNA DNA试验基本原则5动物染毒一定时间后处死并解剖动物,获取靶器官,制备单细胞悬液单细胞悬液与琼脂糖混合后经过裂解过程去除细胞膜,并暴露于强碱性溶液(pH13)中进行DNA解旋,经过电泳、固定、染色,在荧光显微镜下观察,通过分析软件对彗星状细胞进行分析,判定损DNA伤程度每个样品需分析足够数量的细胞进行最终结果评价溶液的配制(所有溶液均现用现配)6低熔点胶以()的浓度溶于(无、和酚红)溶液中,并利用微
0.5%w/v D-PBS Ca2+Mg+波炉加热配好的胶保存在用后弃去37℃〜45℃,()基底层标准琼脂糖凝胶
6.
21.0%-
1.5%w/v常规熔点琼脂糖经微波炉加热溶于磷酸盐缓冲液中(pH
7.0〜
7.4,不含Ca2\Mg+和酚红),制成()标准琼脂糖凝胶
1.0%〜
1.5%w/v裂解液
6.3用纯水配制溶液,裂解液终浓度为100mmol/L EDTA-2Na10mmol/L tris-base
2.5mol/L用或将溶液调至保存于℃冰箱中试验前,NaCL5mol/L NaOH6mol/L HC1pH10,4℃〜8向裂解液中加入()和()保存于℃冰箱至少1%v/v triton-X10010%v/v DMSO,4℃-830mine碱性解旋液和电泳液
6.4用纯水配制溶液,碱性解旋液和电泳液终浓度为和1mmol/L EDTA-2Na300mmol/L NaOH,用前保存于冰箱中,并测定其值pH13,4〜8c pH中和液
6.5用纯水配制溶液,中和液终浓度为(用或调
0.4mol/L tris-base5mol/L NaOH6mol/L HC1节)保存于℃冰箱中pH
7.5,4℃〜8组织匀浆缓冲液
6.6将溶于(无、和酚红)中,终浓度为EDTA-2Na HBSSCa+Mg2+20m mol/L EDTA-2Na,用或将其调至保存于℃冰箱中,使用前加入5mol/L NaOH6mol/L HC1pH
7.5,4℃〜810%DMSOo染液
6.7荧光染料(如、、碘化丙咤或溟化乙锭等),制备DNA SYBRGoldSYBR GreenL Gelred和使用按照产品要求实验动物和饲养环境7动物的选择
7.1动物的选择应符合和的有关规定,选用级健康成年啮齿类动GB
14922.1GB
14922.2SPF物常用周龄以上雄性大鼠实验开始时,动物体重的差异应不超过6±20%动物饲养
7.2动物饲养条件应符合、饮用水应符合、饲料应符合的有关规GB14925GB5749GB14924定可分笼群饲(每笼通常不超过只),也可单笼饲养室内的温度应控制在()522℃±3℃相对湿度应控制在不低于最高不超过(清洁时例外)照明应控制为50%〜60%,30%,70%12光照、黑暗常规饮食,自由饮水h12h动物分组
7.3首先应确定实验分组,动物随机分配为对照组和试验组试验开始前,实验动物至少适应天一般实验设计需要三个剂量组以及阴性和阳性对照组,每组动物至少只编号应使用55创伤较小的方法,包括耳孔法、标签法、烙印法、染色法试验条件8溶剂
8.1溶剂不应该产生毒性作用,并且不应当与受试物产生化学反应如果使用不常用的溶剂,应有数据支持该溶剂在受试动物的应用、暴露途径及检测终点等方面是可行的应根据受试物的理化性质(水溶性或脂溶性)确定受试物所用的溶剂,通常用水、植物油等应当注意的是,某些溶剂(特别是粘稠的溶剂)多次使用后,能诱导炎症反应及在接触部位可能增加链DNA断裂的背景水平样品的制备
8.2固体受试物应溶于适当的溶剂中或混合在饮食或饮水中液体受试物可直接或稀释后染毒用吸入暴露时,根据受试物的物理化学性质,将其处理为气体、蒸汽或气溶胶受试物应现用现配对照
8.3阳性对照每次试验都应设置阳性对照,每种性别至少有只可供分析的动物如需进行3多次采样(例如,用单一的染毒方案),不仅需要在每一个采样点设置阳性对照,而且要确保平行性阳性对照的暴露途径可以与受试物不同阳性对照物质应该能够引起靶器官产生DNA链断裂,可以选择甲磺酸乙酯()作为阳性对照,其已经被证实能够诱发多种组织器官产EMS生链断裂效应阳性对照应选择能够产生中等毒性效应的剂量,同时能够评估试验的可DNA行性和灵敏度,可以根据实验室建立的阳性物剂量-反应曲线进行选择阳性对照组的尾DNA含量(%)应该与实验室前期建立的数据范围保持一致阳性对照物质及其靶器官(作用于啮齿动物)见表也可以选择其他一些被证实阳性的物质1表阳性对照物及其靶器官1化学物及.号靶器官CAS甲磺酸乙酯()所有组织EMS CAS62-50-0乙基亚硝基胭()肝、胃、十二指肠、空肠CAS759-73-9甲磺酸甲酯()肝、胃、十二指肠、空肠、肺及支气管肺泡细胞、肾、MMS CAS66-27-3膀胱、睾丸、骨髓造血系统N・甲基-N-硝基-N-亚硝基胭(CAS胃、十二指肠、空肠)70-25-7二甲基胱哦咤()肝、肠CAS306-37-6甲基亚硝基配(CAS684-93-5)肝、骨髓、血细胞、肾、胃、空肠、脑阴性对照阴性对照组的动物用溶剂单独染毒,其余操作过程与试验组相同,每次试验每个采样点每种组织都应该设置阴性对照阴性对照组的尾含量(%)应该在实验室前期DNA建立的背景数据范围之内必要时增加空白对照剂量设计9受试物应设个剂量组首先通过预试验确定最大耐受剂量,一般取最大耐受剂量及至少3两个适当间隔的剂量水平(优选剂量间隔为疝)对于无毒物质,天或以上的染毒期,最大14染毒剂量采用如果染毒期少于天,最大染毒剂量采用1000mg/kg/BW/do142000mg/kg/BW/do染毒方式10染毒方式一般选用灌胃方式,除一些阳性物质外,一般不建议腹腔注射灌胃或注射一次染毒的最大体积取决于受试动物的体重,灌胃量不应超过体重,水溶液受试物最大1mL/100g染毒量可达到体重2mL/100g采样时间11最佳采样时间是由受试物或染毒途径决定的,依据受试物药代动力学数据[在血浆中达到峰值的时间或组织浓度时,或在多次染毒后的稳定状态在没有动力学数据的情况下,一般在持续两次及以上染毒的最后一次染毒后采样,或在单次染毒后的和2h〜6h2h〜6h16h〜26h均采样在最后一个(或一次性)采样后,在同一时间内尸检所有动物采样时间还可以依据出现在靶器官(如果可用)上的毒作用表现来判断试验方法12组织收集及样本制备
12.1肝脏是最常用来研究并收集数据的组织如果没有任何背景资料或特定组织,即可选取肝脏在某些情况下,也可检查直接接触部位的脏器(如,经口染毒可选取胃)肝脏及胃的组织收集方法如下肝脏:()取约肝左叶中间部分,用冷的组织匀浆缓冲液洗去多余的血细胞;15mm3
(2)剩下的肝左叶部分用福尔马林固定用于病理检查;()取下的肝组织用剪刀剪约次以释放细胞;3100()用组织匀浆缓冲液将剪碎的细胞制成单细胞悬液,轻轻吹打约次,过筛(孔43mL15径)得上清液用于制片;40|im田R
(1)将胃沿胃大弯剪开,用冷的PBS清洗胃部;
(2)胃分为左右两部分,分别用于制片和福尔马林固定病理检查;
(3)用冷的组织匀浆缓冲液清洗用于试验的胃,弃去前胃部分,腺胃浸于现配冷的组织匀浆缓冲液15min〜30min;
(4)胃表面上皮用塑料刮板/解剖刀片或Teflon刀片刮几次后用冷的组织匀浆缓冲液充分冲洗;
(5)用不锈钢压舌板平的那一面/解剖刀片或Teflon刀片轻轻刮胃粘膜5次或更多以释放细胞;
(6)用3mL组织匀浆缓冲液将刮下的细胞制成单细胞悬液,轻轻吹打约15次,过筛(孔径)得上清液用于制片;40|im备注:最好将取下的胃展平后固定在硅胶垫板上再进行细胞的刮取(该垫板也需冰浴)制备玻片
12.2
(1)预涂载玻片制片前,载玻片应用甲醇浸泡过液以除去表面的油脂,风干预涂截玻片保证干净无尘,滴凝胶溶液匹于载玻片上,加上盖玻片,使琼脂糖溶液散开,凝固1%50后取下盖玻片,风干30min()制片过程需在单细胞悬液制备完成内完成用冷的组织匀浆缓冲液将细胞浓度调2lh至个取上述制备好的各组织单细胞悬液与低熔点凝胶混合(应确保玻
2.0x105/mL
0.5%1:10片上的低熔点琼脂糖的百分比不少于)
0.45%
(3)混匀后的单细胞悬液与低熔点琼脂糖混合物均匀铺于第一层凝胶上面,加上盖玻片,置于℃冰箱固化至凝胶凝固,盖玻片可慢慢从琼脂糖上移除45-10min,裂解细胞
12.3载玻片在预冷的裂解液中,于冷藏浸泡中至少(或过夜),应避免暴露于可能4°C〜8c lh含有紫外线的白光,可以使用黄光或避光裂解后使用纯净水、中性缓冲液或磷酸盐缓冲液来冲洗载玻片以去除残留洗涤剂和盐份解旋和电泳
12.4载玻片均衡放置在水平电泳槽中,加入足够的电泳溶液,使得玻片的表面被完全覆盖(覆盖深度应该始终一致),并尽量减少批次之间的变化玻片应该放置至少等待解旋20min,DNA在条件下,电泳时间不少于电泳时间越长(例如可最大
0.7V/cm20min30min〜40min,限度地提高灵敏度)已知诱变剂的阳性反应越强但是延长电泳时间也可能会导致阴性对照组样品过度迁移根据实验需求调整缓冲液的深度以保持电压稳定,以的速度电泳,电
0.7V/cm流应在保持在在电泳开始和结束都需要记录电流用于解旋和电泳通常在℃300mAo4℃〜10避光进行,记录解旋开始时、电泳开始时和电泳结束后的温度电泳后,用预冷的中和缓冲液漂洗玻片至少在℃下干燥后,室温或冷藏5min,3715min保存(湿度不高于)60%染色
12.6使用适当的荧光染料(如、碘化丙咤或淡化乙锭等)DNA SYBRGoldSYBR Greenh Gelred,避光染色可在红光或黄光下进行,避免受试细胞受外界其他因素影响,增加结果的可5min靠性和真实性结果测定方法13使用自动或半自动的图像分析系统来定量评分彗星显微镜使用恰当的放大倍数(如
13.1200倍)进行观察,显微镜上可配备有荧光发射器和适当的检测器或数码照相机(如)CCD分析所有玻片,包括阴性对照和阳性对照,每个样本(每个动物的每个组织)至少观察
13.2个细胞每剂量至少只动物,每只动物计数个细胞在同样的密度下多观察几个视1505150野以确保彗星的尾部没有重叠玻片边缘部分不需要计分单独记录“刺猬状’细胞的发生频率细胞在彗星图像中可分为类图谱,即计分细胞(有清晰的头部和尾部并与相邻细胞没
13.33有干扰)、“刺猬状”细胞和不计分细胞(如彗星头、彗星尾不清晰或重叠细胞等),其中只有计分细胞能够进行尾部百分比的分析,避免伪影DNA彗星试验链断裂的观察终点以尾部含量(也称尾部强度)作为结果评价与分
13.4DNA DNA析的指标试验结果的评价试验结果计算方法每个样本(每个动物的每个组织)至少观察个
1414.1150细胞,计算每个细胞的终点指标(尾长、尾矩、尾含量),每个终点指标首先计算DNA150个细胞的平均值,再计算每剂量组只动物的平均值作为该剂量组该项指标的结果5每个细胞的终点指标=□□二空口容剂对照4白对照组7=受试组或阳性物终点测定指标(尾长、尾矩、尾部含量)DNA二溶剂对照组终点测定标(尾长、尾矩、尾部含量)平均值口容剂对照组M DNA空白对照组终点测定指标(尾长、尾矩、尾部含量)平均值方空白对照组=DNA试验满足以下标准,则认为试验成立
14.2阴性对照组数值落在实验室预先建立的历史阴性对照数据范围内,且阴性对照组尾部DNA含量百分比值应V8%;阳性对照组数值落在实验室预先建立的历史阳性对照数据范围内,且与阴性对照组数值相比差异有统计学意义;受试物组与平行阴性对照组相比,尾部含量百分比值增加且差异有统计学意义,并
14.3DNA有明显剂量-反应关系,则判定该受试物体内彗星试验结果阳性,认为在本试验体系中,该受试物可诱导靶组织细胞断裂;若尾部含量百分比增加且差异有统计学意义,但无剂DNA DNA量-反应关系,则应进行重复试验,结果能重复可判定为阳性;若受试物所有剂量组尾部DNA含量百分比值与阴性对照组相比差异无统计学意义,则判定该受试物体内彗星试验结果阴性,在本试验体系中受试物不能诱导靶组织细胞的断裂DNA试验报告15试验报告应包括以下内容()试验名称、试验单位名称、报告编号;1
(2)受试物名称,批号、理化性状、配制方法、所用溶剂及配制;
(3)动物种属和品系、体重、数量、来源(注明合格证号和动物级别);()动物饲养环境,包括饲料来源、室温、相对湿度、实验动物室合格证号;4()剂量和组别剂量选择原则、剂量和组别、阴性和阳性对照物和剂量;5()试验条件和方法受试物的准备过程及染毒过程描述、靶器官选择原则、简述解剖6及组织器官分离过程及单细胞悬液的制备方法、裂解液及解旋、电泳液的主要成份描述、电泳条件、染色技术,所采用的统计学方法;
(7)试验结果记录每只动物的健康状况和体征观察情况,每只动物观察和分析细胞数,以列表方式报告每组动物的尾部百分比和“刺猬状”细胞发生率,剂量-反应关系,给出DNA数据的统计结果,以及组织病理检查结果及是否有病理性损伤;
(8)试验结论阳性结果表明,在本试验条件下受试物具有引起哺乳动物靶组织细胞DNA损伤的作用;阴性结果表明,在本试验条件下受试物不引起哺乳动物靶组织细胞损伤DNA。