高压氧下大鼠脑缺血区域脑组织基质金属酶-9表达及促进大鼠脑缺血损伤恢复的机制

高压氧下大鼠脑缺血区域脑组织基质金属酶-9表达及促进大鼠脑缺血损伤恢复的机制高压氧治疗脑损伤可归因于改善的氧分压，保持大脑瘫痪的完整性，减少脑水肿，减少炎症损伤，降低脂质过氧反应，遏制细胞坏死等机制然而，高压氧治疗脑损伤的精确机制尚不清楚基质金属酶-9（WP-9）被认为参与了脑缺血缺氧后的病理生理过程，脑缺血时MMP-9上调并且可以直接导致神经元死亡，而应用广谱MMP-9抑制剂或抗体可减少脑梗死的体积本研究通过观察高压氧对大鼠脑缺血区域脑组织MMP-9的表达，探讨高压氧治疗下大鼠脑缺血的作用机制，现报道如下1材料和方法

1.1实验材料

1.

1.1wi企业模型分组健康成年Wistar鼠32只，雌、雄不限，体质量250~300g采用随机数字表法将32只成年Wistar鼠分为模型组（16只）和假手术组（16只），两组均分别行高压氧治疗（8只）和高压空气治疗（8只）高压空气组与高压氧治疗组在时间、治疗次数方案上相同，均1次/d,共3d

2.

1.2小鼠卵白素-生物素过氧化酶开环小鼠igg、小鼠igg及卵白素-生物素过氧化酶体系表1主要试剂有ELISA试剂盒、小鼠抗GAP-43单克隆抗体（试剂号G9264,SIGMA）、生物素结合的马抗小鼠Ig G及卵白素-生物素过氧化酶复合物（ABC1100,Vector）主要仪器有恒温电热干燥箱、高压氧舱、leitz Kryomat1700型组织冰冻切片机（德国）、荧光显微镜、紫外分光光度计及显微图象分析系统等

1.2方法

1.

2.1脑缺血动物麻醉后效果参考Longa线栓法制作脑缺血模型，所有大鼠均以左侧为栓塞侧试验动物10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射进行麻醉后仰卧固定于手术台上，取颈正中切口，分离左颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉以及颈外动脉的分支，将尼龙丝从颈外动脉插入颈内动脉直至阻断大脑中动脉起始处，缝合皮肤切口脑缺血动物麻醉清醒后可表现为提尾后右侧前肢屈曲内收，爬行时向右侧转圈，凡具备以上体征方可入选本实验假手术组除不插线外，其余步骤同上降压和治疗时间

（1）高压氧治疗:用纯氧8~10L/min流量洗舱10~15min,使舱内氧浓度〉95猊20min内缓慢加压至

0.25MPa后停留60min,这期间用纯氧通风10min,停留结束后以20min匀速减压至常压，结束治疗；

（2）高压空气治疗:维持舱内氧浓度在21%,压力至

0.25MPa后停留60min,停留结束后以20min匀速减压至常压，结束治疗

1.

1.

12.3脑含水量检测分别取左右大脑半球的后半部分用干湿法测定大鼠处死后立即开颅，取缺血侧或假手术侧大脑半球后部一块全层脑组织，装入称量杯称取湿重后，放入恒温电热干燥箱105c烘烤至恒重为止，按Elliott公式计算含水量（给二（湿重一干重）/湿重义100虬

1.

2.4eb含量测定分别取左右大脑半球的前半部分用甲酰胺法测定取缺血侧或假手术侧大脑半球前部一块全层脑组织，称取重量后加入甲酰胺，水浴，取脑EB液测定光密度，波长632nm,蒸储水作空白比色，按标准曲线计算EB含量

1.

2.5载体的制备取大脑皮层脑组织匀浆，用ELISA试剂盒检测MMP-9o用纯化的MMP-9抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的MMP-9抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中的MMP-9呈正相关，用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（值），计算样品浓度

1.3统计方法应用SPSS

14.0统计软件进行处理计量资料以均数土标准差表示，采用t检验P

0.05为差异有统计学意义2假手术组与高压空气治疗mmp-9的比较治疗第4天大鼠模型组在高压氧治疗下脑含水量、脑组织EB定量及MMP-9含量均小于高压空气下的治疗，差异均有统计学意义（均P

0.05）假手术组在高压氧下治疗和高压空气治疗的差异均无统计学意义（均P〉

0.05）见表1,2,3o3模型大鼠脑缺血再灌注前后eb含量的变化组织缺血、缺氧是脑缺血性损伤的最直接原因大脑中动脉（MCA）阻塞后，脑组织氧分别降低50%90%,脑血流（CBF）降低70%90%,皮层诱发电位（CEF）幅度在缺血半球降低20%〜〜95%,高压氧治疗具有增加血氧含量、提高动脉氧分压（Pa0〜模型组脑组织EB定量检测发现，高压氧治疗脑组织中的EB含量少于高压空气治疗，提示脑缺血再灌注高压氧治疗后血脑屏障破坏的通透性明显增加本实验中假手术组大鼠在高压氧和高压空气治疗下，脑组织EB定量检测含量明显小于模型组，这与假手术组无血脑屏障破坏，仍有微量EB残留在脑内毛细血管腔及血管壁有关MMP-9是基质金属蛋白酶系一员，是一种依赖锌离子的金属蛋白酶，主要功能是降解和重塑细胞外基质，在中枢神经系统，中性粒细胞被认为是脑血管病急性损伤时MMP-9的重要来源，其表达高峰（缺血再灌注后2472h）与标志血脑屏障破坏程度的EB外渗情况一致〜。