耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属-内酰胺酶的检测及基因分型

耐亚胺培南铜绿假单胞菌金属-内酰胺酶的检测及基因分型铜绿假单胞菌广泛分布于自然界土壤、水和空气中这种菌存在于人体的皮肤、肠道和呼吸道中该菌是医院感染的主要病原体之一1菌株鉴定及per扩增

1.1菌株来源收集本院2010年1月-2012年12月临床分离的116株耐亚胺培南铜绿假单胞菌，排除同一患者同一感染部位的菌株

1.2质控菌株铜绿假单胞菌ATCC27853为阴性对照，经测序鉴定为VIM和IMP型金属8-内酰胺酶的铜绿假单胞菌为阳性对照

1.3培养鉴定按照《全国临床检验操作规程》对所分离的菌株进行分离培养，采用VITEK-2全自动微生物鉴定系统对所收集的菌株进行菌种鉴定

1.4化学试剂、培养基和药敏纸片EDTA-Na

1.5双纸片协同试验结合增强试验检测金属8-内酰胺酶表型

1.6PCR法检测金属B-内酰胺酶基因型

1.

6.3PCR反应体系及参数PCR反应总体积为20Hl,其中引物各

0.5u1,Premix Taq酶10ul,DNA模板1u1,加无菌双蒸水至20ul扩增条件94c预变性10min,94℃变性30s,52℃退火30s,72℃延伸50s,一共35个循环，最后72℃延伸5min扩增产物于L5%琼脂糖凝胶电泳，时间为40min,电压100V,然后在溪化乙锭中染色，紫外凝胶成像仪下成像

1.

6.4扩增产物的测序与分析电泳成像具有单一条带的标本，其PCR产物直接送上海英俊公司进行测序，具有非特异性条带的标本采用胶回收纯化试剂盒进行纯化回收后送测序测序结果在Gen Bank数据库中进行比对分析（网址http://nebi.nlm.nih.gov/BLAST）o2mbl基因检测

2.1双纸片协同试验结合增强试验检测MBL表型结果双纸片协同试验依照CLSI推荐的标准纸片扩散法（K-B法）步骤操作，共检出7株MBL阳性的铜绿假单胞菌（图1）,MBL的检出率为6%（7/116）o

2.2PCR法检测MBL基因的结果在表型阳性的耐亚胺培南铜绿假单胞菌中共有2株扩增出VIM型MBL基因，5株扩增出IMP型MBL基因，见图

22.3PCR测序和比对结果PCR产物送上海英俊生物技术有限公司进行测序，经过测序，并在GenBank数据库中进行比对分析后发现，7株金属B-内酰胺酶基因阳性的铜绿假单胞菌中2株是VIM-2型MBL图2:

3.4,5株是IMP-9型MBL图2:6-10o图2中5号标本电泳疑似为VIM型MBL、11号标本疑似为SPM型MBL,但测序结果均排除了这个疑似

3.per检测金属酶基因的方法铜绿假单胞菌是条件致病菌，也是医院感染的常见病原菌，由于其膜通透性低而对多种抗生素天然耐药，而抗生素的广泛及不合理使用使之容易获得性耐药，给治疗带来很大的困难，临床用于治疗铜绿假单胞菌感染可选用的抗生素范围比较窄，常用的主要是内酰胺类、氨基糖甘类和喳诺酮类试验结果显示本院耐亚胺培南铜绿假单胞菌中金属B-内酰胺酶表型阳性的菌株有7株,经PCR检测MBL基因阳性的菌株亦为这7株，MBL的检出率6%,试验结果表明本研究中使用的金属酶表型检测方法所获得的MBL阳性结果与利用PCR方法检测所获得的实验结果完全一致，基层临床微生物实验室完全可以利用双纸片协同试验结合增强试验代替PCR法检测铜绿假单胞菌的金属B-内酰胺酶这7份MBL阳性的基因经测序、比对后发现2份为VIM-2型MBL,5份为IMP-9型MBL实验结果表明本院耐亚胺培南铜绿假单菌产生的金属酶基因型并没有出现多类型化的特征，仍然以IMP型和VIM型为主，但是鉴于目前临床抗生素滥用情况严重，对耐药铜绿假单胞菌常见耐药基因型的监测还应继续进行有研究报道，铜绿假单胞菌是医院环境中的常见菌，而金属酶基因阳性的铜绿假单胞菌多表现为多重耐药实验中出现了目的基因PCR检测假阳性的结果一个PCR扩增条带与VIM型目的靶序列条带一致，另一个PCR扩增条带与SPM型目的靶序列条带一致，但测序显示该产物并不是相应的目的基因出现这种结果的原因可能为1由于引物设计不合适，选择的目的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列；2靶序列太短或引物太短也容易出现假阳性，需重新设计引物；3也可能是由于靶序列或扩增产物的交叉污染，这种污染有两种原因1是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性这就提示在操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒；所用离心管及样进枪头等均应一次性使用；最好在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸2是空气中的小片段核酸污染，这些小片段核酸比靶序列短，但有一定的同源性，可互相拼接,与引物互补后，可扩增出阳性的PCR产物，这些可以用巢式PCR方法来减轻或消除细菌DNA提取采用煮沸法提取细菌DNA从分离平板上挑取单一菌落，放入200u1的无菌双蒸水中，混匀，100℃水浴10min,放置-4℃10min,12000r/min离心10min取上清置于-20℃保存

1.

6.2引物合成引物合成参照文献报道。