铜绿假单胞菌碳青霉烯酶表型及基因分析

铜绿假单胞菌碳青霉烯酶表型及基因分析目前，中国关于碳绿霉酶铜绿假单胞菌的研究正在开始为了解铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药状况，我们随机抽取20株本院近期临床分离的铜绿假单胞菌，采用K-B法进行药物敏感试验;通过2-疏基丙酸协同试验、改良三维试验、聚合酶链反应（PCR）、基因测序等方法，分析这20株铜绿假单胞菌的耐药表型及所产的碳青霉烯酶基因型，以期发现铜绿假单胞菌的耐药现状、耐药趋势及其产碳青霉烯酶的基因型特点，来指导临床合理使用抗生素

11.1材料表面

1.

1.1vitek细菌鉴定回顾分析2005-0710从临床分离的铜绿假单胞菌中，随机抽取20株菌株，均经法国生物〜梅里埃公司VITEK II细菌鉴定仪重新鉴定，其中19株菌来自痰标本，1株菌来自创口分泌物铜绿假单胞菌ATCC27853,大肠埃希菌ATCC

25922、肺炎克雷伯菌ATCC

700603、大肠埃希菌ATCC35218为本室保存的质控菌株

2.

1.2仪器和试剂

3.

1.

2.药敏纸片和丙酸钠c亚胺培南（IMP）、氨曲南（ATM）、阿米卡星（AK）、哌拉西林（PRL）、哌拉西林/三哇巴坦（TZP）、头胞哌酮（CFP）、头胞哌酮/舒巴坦（SCF）、头抱他咤（CAZ）、头抱毗后（FEP）、头抱嚷后（CTX）、环丙沙星（CIP）、头抱西丁（F0X）等药敏纸片购自英国OXOID公司;M-H琼脂购自杭州天和公司；氯理西林购自哈药总厂;2-筑基丙酸购自Sigma公司；UNIQT0柱式质粒小量抽提试剂盒、SDS TrisN-Lauryl Sarcosine蛋白酶K、溶菌酶、EDTA、Taq DNA酶、dNTP、限制性内切酶Spel、DNA分子标记物、PFGE琼脂糖、低熔点琼脂糖均购自上海生工生物工程有限公司

4.

1.

2.dna扩增检测法国生物梅里埃公司VITEK II细菌鉴定仪;美国PE9600DNA扩增仪;德国Sigma公司低温超速离心机；电泳仪、紫外透射仪为北京六一厂产品；日本三洋Ultra-Low超低温冰箱（-85℃）o

1.2方法

1.

2.1菌株敏感性检测采用纸片琼脂扩散法K-B法测定试验菌株对12种抗菌药物的敏感性，参照美国临床实验室标准化委员会NCCLS2003年标准判断结果菌株产金属酶的检测将待测菌配制成

0.5个麦氏单位，均匀涂布在M-H平板上，中间贴CAZ药敏纸片，距纸片

3.0cm贴一空白纸片，加

2.0UL2-筑基丙酸原液，35℃培养过夜，如靠近2-筑基丙酸侧CAZ抑菌环有扩大者，则表示菌株产金属酶

1.

2.3rpm离心率将新分离的待测菌密涂于1/4M-H平板直径

9.0cm±35℃,24h后用灭菌棉棒取下全部菌苔于L0niL灭菌生理盐水中，置-85℃低温冰箱，反复冻融69次在4℃条件下12000〜rpm离心2h,抽取上清液经MTI平板上常规细菌培养阴性后为合格粗提酶以新培养的大肠埃希菌ATCC

259220.5个麦氏单位均匀涂布M-H平板，中心分别贴IMP10ng、CTX30ng、FOX30u g纸片，距纸片边缘

5.0mm处，由里向外切出3个

1.0mm宽15mm长的槽，于槽内分别加入50u L酶粗提液，42U L酶粗提液+

8.0□L氯唾西林

2.0mmol/L,42u L酶粗提液+

8.0uL EDTA

0.1mol/L,35℃孵育过夜，观察结果

1.

4.4细菌质粒的提取提取细菌质粒DNA:采用上海生工的UNIQ-10柱式质粒小量抽提试剂盒提取细菌质粒DNAoPCR:

①PCR反应体系为50UL体系，含有lOXbuffer

5.0n L,25mmol/L MgClPCR产物用2%的琼脂糖凝胶电泳，澳化乙唳染色，紫外灯下观察结果并拍照

1.

4.5测序选取有代表性的PCR产物送至上海生工生物工程有限公司，进行DNA序列测定

22.1头孑包西丁敏感性试验从药敏结果可以看出，20株试验菌对阿米卡呈敏感率最高，为85%;其次为氨曲南、环丙沙星、头抱此月亏，其敏感率分别为75%、70%、65%,亚胺培南敏感率为55%;头抱西丁全部耐药，敏感性结果见表1从PRL/TZP和CFP/SCF的药敏协同现象初步推断,有14株菌（

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19、20号），可能产B-内酰胺酶（ESBLs）,我们将进一步做ESBLs的确证试验，来验证这一推断

2.22-mpa协同试验在20株试验菌株中，其中有9株试验菌株（

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18、19号）2-MPA协同试验阳性，即在靠近271PA一侧的CAZ抑菌环有不同程度的扩大，显示有协同效应，它们产金属B-内酰胺酶

2.3主要菌株的表达情况检测，主要有

3、

4、

8、16号通过三维水解试验，可将本试验的20株菌株的产酶情况分成7组第1组:未见水解亚胺培南，酶提取物活性能被EDTA抑制，不能被氯嘎西林抑制，此现象说明其所产的金属酶对亚胺培南的水解能力较弱，且未产生AmpC酶，显示此表型的菌株有

1、

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10、11号共6株菌第2组:可见水解亚胺培南，酶提取物活性能被EDTA抑制，不能被氯哇西林抑制，此种表型说明其所产的金属酶对亚胺培南的水解能力较强，且未产生AmpC酶，显示此表型的有

12、

14、15号共3株菌第3组:可见水解亚胺培南，酶提取物活性未能被EDTA及氯理西林抑制，此种表型说明其所产的金属酶对亚胺培南的水解能力较强，其所产的金属酶产量也较高，本试验EDTA的用量已不够来完全抑制其所产的金属酶，且未产生AmpC酶，显示此表型的只有2号菌第4组:可见水解亚胺培南，酶提取物活性未能被EDTA,能被氯哇西林抑制，此种表型说明其所产的金属酶对亚胺培南的水解能力较强，其所产的金属酶产量也较高，本试验EDTA的用量已不够来完全抑制其所产的金属酶，且有AmpC酶产生，显示此表型的有19号菌第5组:未见水解亚胺培南，酶提取物活性能被EDTA及氯隆西林抑制，此种表型说明其所产的金属酶对亚胺培南的水解能力较弱，且有AmpC酶产生，显示此表型的有

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8、16号共4株菌第6组:可见水解亚胺培南，酶提取物活性能被EDTA及氯哇西林抑制，此种表型说明其所产的金属酸对亚胺培南的水解能力较强，且有AmpC酶产生，显示此表型的有

5、13号共2株菌第7组:可见水解亚胺培南及头抱西丁，酶提取物活性能被EDTA抑制，未能被氯嗖西林抑制，此种表型说明其所产的金属酶对亚胺培南的水解能力较强，有AmpC酶能不被氯嗖西林抑制，显示此表型的有

17、18号共2株菌3质粒传导的碳青霉烯酶基因在临床上的耐药问题铜绿假单胞菌PA是医院感染的主要条件致病菌，是引起呼吸道、泌尿道和伤口感染的主要病原菌之一由于铜绿假单胞菌对多种抗生素天然耐药，使得临床抗生素的选择越来越受到限制在所有B内酰胺类抗生素中，碳青霉烯类具有最广泛的抗菌活性，它对革兰氏阴性菌产生的超广谱B-内酰胺酶ESBLs、AmpC酶都很稳定；亚胺培南imipenem为碳青霉烯类抗生素，有极强的抗菌活性，特别适用于治疗严重的医院感染及免疫缺陷患者在过去，绝大多数的金属内酰胺酶基因是由染色体编码的，因此限制了此酶在菌株间的传播，因而导致临床普遍蔓延的可能性不大但是目前，质粒介导的金属内酰胺酶在铜绿假单胞菌、脆弱拟杆菌、黏质沙雷菌等菌株中被相继发现Bandoh等由于质粒介导的碳青霉烯酶的出现及其广泛传播，加上亚胺培南等碳青霉烯类药物的广泛使用，导致在本地区铜绿假单胞菌存在多种类型的碳青霉烯酶耐药基因，本地区存在质粒介导的碳青霉烯酶基因临床普遍蔓延的可能性为了有效控制感染，避免这种现象继续发展恶化，我们应当密切监视本地铜绿假单胞菌耐药性变化趋势，对其所产碳青霉烯酶进行研究，一方面可全面正确认识其耐药机制，有助于控制感染；另一方面，铜绿假单胞菌有可能是多种耐药基因的传播源，这一工作将有助于了解和控制医院内耐药基因的播散和流行；临床医生应严格依据药敏试验结果，合理使用抗生素，尽量减少碳青霉烯类抗生素的使用；同时医院应加强院内感染控制否则，产碳青霉烯酶的多药耐药的铜绿假单胞菌将越来越多，我们将陷入无药可用的困境，碳青霉烯酶将成为本地区抗感染治疗的难题。