藏药小皮对糖尿病大鼠视网膜蛋白激酶c、血管内皮细胞生长因子和低氧诱导因子的影响

藏药小皮对糖尿病大鼠视网膜蛋白激酶、血管内皮细胞生长因子和C低氧诱导因子的影响视网膜微血管损伤是糖尿病视网膜病变（r）的典型象征性病变藏医学认为DR属于“京尼萨库病”（糖尿病）的范畴，“视觉（能视赤巴）住眼能将诸物见”1材料和方法

1.1实验动物一^种g动物SPF级雄性SD大鼠64只，体质重180220g,由四川省医学科学院实验动物研究所生产提〜供，合格证号SYXK（川）2009-124o

1.2特效药小聚皮药材，由西藏自治区藏药厂达娃顿珠提供，为藏医临床使用的“白小聚”，符合六省区藏药标准

1.3实时量perMotic BA400显微摄像系统（麦克奥迪公司）；Image-Pro Plus图像分析系统（MediaCybernetics,Inc.公司）；RM2015切片机（德国克林蓝公司）；图像分析软件，Motic ImagesAdvanced;ABI-7500实时定量PCR检测仪（美国ABI公司）；倒置相差显微镜（日本Olympus公司）；兔抗鼠HIF-1抗体（E10J015）、兔抗鼠VEGF抗体（批号E10J013）,兔抗鼠PKC抗体（批号E10J012）均购于武汉博士德生物工程有限公司；盐酸小疑碱对照品，中国药品生物制品检定所提供

1.4动物模型的建立和分组给药大鼠禁食12h后一次性腹腔注射40mg-kg

1.5实时荧光定量per检测取100mg视网膜组织，按Trizol试剂盒说明书提取总RNA按荧光定量PCR（SYBR GREEN）反应体系进行SYBRMIX10uL,上游引物

0.5H L,下游引物

0.5/L,cDNA模板

0.8口L每个样本重复2次，上机，进行Real TimePCR扩增和检测PCR反应条件50℃2min,95℃10min,95℃20s扩增,40个循环，60℃60s,40个循环，95℃10min,读取融解曲线以B-actin内参基因，引物核甘酸序列见表

11.6蛋白质表达动力学取100mg视网膜组织放入到1mL裂解液中，加入抑制剂后使用匀浆器充分研磨研磨完毕在4℃离心机离心，转速为12000rpm,离心10min取上清；采用用新式的Nano Drop测定蛋白浓度；取组织裂解蛋白100ug,经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳后，电转移至PVDF膜；小心取出PVDF膜，用TBST洗两遍，用含5%脱脂奶粉的封闭液37c封闭1h；加入用5%脱脂奶粉的TBST1300稀释的一抗，室温振摇，与膜共同孵育1小时，转为4°C过夜；TBST洗膜，室温振摇，10min3次；加入13000稀释的辣根过氧化物酶标记的相应二抗，与膜共同孵育1h,室温振摇，TBST洗膜，室温振摇，10min5次；四甲基联苯胺（TMB）显色，Gene图像分析仪摄像、分析，目的蛋白相对含量以目的蛋白/（内参）B-actin的灰度值表示

1.7免疫组化染色法测定了hif-a的发现视网膜组织石蜡包埋，切片，常规脱蜡，置枸檬酸溶液（pH=

6.0）中，9298℃加热10min,〜冷却置3%H

1.8统计处理所有数据统计均用SPSS

13.0软件进行分析，数据均以2结果与分析

2.1小皮中、低剂量对pkc-蛋白表达的影响PCR结果显示，与对照组比较，模型组PKC-BmRNA显著升高（PV

0.01）；与模型组比较，小桀皮高剂量组比模型组PKC mRNA表达水平显著下降（P

0.01）,小嬖皮中、低剂量组和二甲双胭组及小樊碱组PKC-BmRNA表达水平明显下降（P

0.05）羟苯磺酸钙组PKC-B mRNA表达有下降趋势；Western Blot结果显示，与对照组比较，模型组PKC-B蛋白表达显著升高（P

0.05）,与模型组比较，小莱皮干预后高剂量组PKC-B蛋白表达明显降低（P〈

0.05）,小樊碱组、二甲双月瓜组和羟苯磺酸钙组较模型组PKC-B蛋白表达下降，但差异不显著具体见表

1、2,图

12.2大鼠vegf蛋白表达PCR结果显示，与对照组比较，模型组VEGF mRNA表达显著升高（P

0.01）；与模型组比较，小聚皮各剂量组VEGF mRNA表达水平显著降低（P

0.01）,小聚碱组、二甲双服组和羟苯磺酸钙组较模型组VEGF mRNA表达明显下降（P

0.05）;Western Blot结果显示，与正常组比较，模型组VEGF蛋白表达明显升高（P

0.05）；与模型组比较，小樊皮高、中剂量组VEGF蛋白表达显著降低（P

0.01）,小樊皮低剂量组VEGF蛋白表达明显降低P

0.05,羟苯磺酸钙组、小聚碱组VEGF蛋白表达明显降低P

0.05,二甲双肺组较模型组差异不显著具体见表1,表2,图

12.3视网膜中hosl蛋白表达PCR结果显示，与对照组比较，模型组HIF-lamRNA表达明显升高P

0.05；与模型组比较，小聚皮高剂量组、中剂量组HIF-lamRNA表达水平显著降低P

0.01，小桀碱组、小聚皮低剂量组和二甲双月瓜组HIF-la mRNA表达水平明显降低P

0.05,羟苯磺酸钙组较模型组差异不显著Western Blot结果显示，与对照组比较，模型组HIF-1a蛋白表达明显升高P

0.05；与模型组比较，小集碱组、小莱皮各剂量组和羟苯磺酸钙组HIF-1Q蛋白表达明显降低P

0.05,二甲双脏组蛋白表达较模型组下降，但差异不显著见表

1、2,图lo免疫组化染色结果显示各组HIFTa蛋白表达呈棕黄色或黄色为阳性表达，主要表达在视网膜内从状层，正常组表达少或没有表达；而模型组表达多，颜色也深对各组阳性表达的平均吸光度进行统计比较，结果显示与对照组比较，模型组HIFTa吸光度明显升高P

0.05；与模型组比较，小聚碱组、小嬖皮高剂量组、中剂量组和二甲双脏组及羟苯磺酸钙组平均吸光度明显降低P

0.05o具体见表3,图

23.“pkc-实”dr信号通路检测大鼠视网膜vegfDR患者伴随长期慢性的高血糖和缺氧反应，存在高血糖-HIF信号通路，通过PKC等途径,可与HIF启动子结合，增加HIF-lamRNA表达，从而增加VEGF等HIF诱导基因的表达高糖环境下，血管组织主要激活的PKC-B,是VEGF的一种重要的信号成分，在调节内皮细胞渗透性方面起重要作用，抑制PKC-B可以阻止和逆转DR的发生及视网膜缺血导致的新生血管形成，并可抑制VEGF导致的视网膜渗漏和内皮细胞生长VEGF是DR发生、发展的危险因子，在DR患者的血浆、房水、玻璃体中均可检测出VEGF的过度表达因此，在DR的发生、发展中可能存在低氧诱导的“HIF-PKC-VEGF”信号通路，本研究中,模型组大鼠视网膜PKC-B、VEGF、HIF-la mRNA和蛋白表达均显著增加，给予小樊皮治疗后，3者的表达均显著减少，提示小莱皮防治DR的作用机制可能与“PKC-HIF-VEGF”信号通路的整体多点调控有关，鉴于DR的复杂分子机制仍然是药物发现的主要障碍，为充分发挥藏医药防治糖尿病及其并发症的特色优势，将进一步结合血清药物化学等方法进行深入研究。