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杂交瘤技术基本程序与方法
一、杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果,抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等,为杂交瘤技术提供了必要理论基础,同时,骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备年月日,在英国《自然》杂志上发表了题为分“泌具有预定特异性抗体的融合细197587Kohler^Milstein胞的持续培养”的著名论文他们斗胆地把以前不同骨髓瘤细胞Continuous cultui-es offused cellssecreting antibodyof predefinedspe cif icity之间的融合延伸为将丧失合成次黄喋吟-鸟喋吟磷酸核糖转移酶的骨髓瘤细胞与经绵hypoxanthine guanosinephosphoribosyl transferase,HGPRT羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合融合由仙台病毒介导,杂交细胞通过在含有次黄喋吟、氨基喋吟和hypoxanthine,H aminopterin,A胸腺喀咤核甘的培养基中生长进行选择在融合后的细胞群体里,尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是thymidine,T HAT但不能连续培养,只能在培养基中存活几天,而未融合的骨髓瘤细胞和相互融合的骨髓瘤细胞不能在培养基HGPRT+,HGPRT-HGPRT-HAT中存活,惟独骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性,而在HGPRT HAT培养基中存活下来实验的结果彻底像起始设计的那样,最终得到了不少分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤,即所谓杂交瘤生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体,即单克隆抗体这一技术建立后不久,在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进最早仙介病毒被用做融合剂,后来发现聚乙二醇PEG的融合效果更好,且避免了病毒的污染问题,从而得到广泛的应用随后建立的骨髓瘤细胞系如和都是既不SP2/-Agl4,X63-Ag
8.653NSO/1合成轻链又不合成重链的变种,所以由它们产生的杂交瘤细胞系,只分泌一种针对预定的抗原的抗体份子,克服了骨髓瘤细胞等M0PC-21的不足再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系,但其基本原理和方法是一样的
二、基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上,各实验室使用的程序不尽一致本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序,该程序适合国内大多数实验室在开展杂交瘤技术制备单抗之前,培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备超净工作台、恒温培养箱、超低温冰箱CO,、倒置显微镜、精密天平或者电子天平、液氮罐、离心机水平转子,、℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等其需要-70C4000r/min37的主要器械包括、、细胞培养瓶,、刻度吸管,试管,滴管弯头、直头,平皿,烧杯,、盐100ml50ml25ml10ml1ml500ml250ml100ml水瓶,青霉素小瓶,、、注射器等,孔、孔细胞培养板,融合管圆底带盖玻璃或者塑料离心管,眼科剪刀,眼科镜,10ml5ml1ml962450ml血细胞计数板,可调微量加样器弯头针头,目筛网,小鼠固定装置等止匕外,杂交瘤细胞的筛选与检测的仪〜50uL〜200ul,-1000U1,200器设备,依据检测单抗的方法不同而各异,请参阅本节有关部份淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等,图概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程6-
1、动物免疫1抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原,从纯度上说虽不要求很高,但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加,同时可以减轻筛1选的工作量因此,免疫抗原是越纯越好,应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定普通来说,抗原的来源有限,或者性质不稳定,提纯时易变性,或者其免疫原性很强,或者所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或者分析等,免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯,但抗原中混杂物不少,特殊是如果这些混杂物的免疫原性较强时,则必须对抗原进行纯化检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同,也可是不同的纯度,这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物因为,所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来2源于小鼠,所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于大鼠,所以普通的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免BALB/c LOU/c
①器材和试剂、绵羊抗凝血,或者人P型抗凝血ab、缓冲液PBSPH
7.2;醋酸缓冲液、甲醛,丙酮醛,抗凝剂等c NaN,
3、血凝板,振荡器等d
②多糖抗原的间接血凝试验、甲醛化绵羊红细胞的制备无菌采集绵羊颈静脉血用枸椽酸钠作抗凝剂;用倍于红细胞压积的a50ml,5PH
7.2PBS Na HPO12qo
3.58g,24蒸储水充分洗涤次,每次分钟,直至上清测定无蛋白质用饱和硫酸镂滴定上清,观察有无KH PO
0.41g,NaCl
8.01g,1000ml51500r/min5-1024白色沉淀,再以相同缓冲液配成25%红细胞悬液;将25%红细胞悬液与20%甲醛以
2.51的比例混匀,37℃水浴作用2小时,每15分钟振荡一次,红细胞颜色逐渐由鲜红色转变为棕色;以洗涤次,每次分钟,再以同样的制成红细胞悬液;其PH
7.2PBS42000i7min10PBS25%后,重复醛化一次,方法同前;最后配成醛化绵羊红细胞悬液,加甲醛至防腐,保存备用20%
0.3%4℃、脂多糖抗原致敏甲醛化绵羊红细胞的制备取脂多糖以液,调整多糖浓度至然后水浴处理b LPS,
0.2mol/LPH
8.0PB120ug/ml,100℃小时;将冷却至的热处理与醛化红细胞等量混合,搅拌作用分钟;取出离心分钟,以137℃LPS6%37℃452XXr/min
100.01mol/LPH
7.2PBS洗涤次;配制成致敏血球,分装,保存于备用,或者冻干保存44%4℃、的筛选取待测样品加入型微量血凝板孔中,同时设立阴性、阳性对照;再加入致敏红血球悬液此c McAbMe Ab253,V
0.5-4%25在振荡器上混匀秒;置室温或者分钟观察结果阴性对照孔应呈紧缩的圆点3037c3P60
③可溶性蛋白抗原的间接血凝试验、红细胞醛化采用双醛法采绵羊或者人型抗凝血,每次加倍于红细胞压积的洗涤牛次,然后配成红细胞悬液;a010PBS68%向此红细胞悬液缓慢加入等量含有丙酮醛和甲醛的于室温缓慢搅拌小时;其后洗涤次,配成双醛化红细胞悬液,8%3%3%PBS,17320%加防腐,保存备用
0.1%NaN34℃、致敏红细胞取双醛化红细胞分钟,弃上清,沉积红细胞加醋酸-醋酸钠缓冲液并加b20%
0.1ml,15OOi7minlO.2mol/L PH
4.01mL最适浓度应预先测定,蛋白抗原为摆布的抗原混匀,于℃致敏分钟,有时轻轻摇动,使红细胞不下沉然后离心去上50ug/ml1ml,4530清,并用倍于红细胞压积的洗次,最后用配成致敏红细胞,保存备用20PBS34PBS
0.5-1%4℃、测定同上法c McAb放射免疫测定4放射免疫测定是用放射性同位素标记抗原或者抗体,以检测相应抗原或者抗体的定量方法在筛选和鉴定单抗时常用抗原固相法,即用抗原包被聚乙烯微板,借以检测样品中的其操作步骤如下McAb,、用碳酸盐缓冲液将抗原稀释至适宜的浓度滴加聚乙烯微板孔内,孔,过夜或者小时a l-100ug/ml,lOOul/4℃37℃
2、弃去抗原液,每孔加含的小时封闭b lOOul
0.5-l%BSA PBS,4℃1-
2、用洗涤次,每次分钟c BSA-PBS33d、加待检样品,每孔lOOul,设立阴性孔、阳性孔和空白孔;37℃1・2小时,同法洗涤、每孔加标记的抗鼠抗体工作液小时,同法洗涤e1251Ig lOOul,37℃1-
2、用射线闪烁计数仪分别测定各孔放射性通常要求样品孔和阳性对照孔的放射性脉冲分别超过本底倍和倍若以空白孔的放f510射性为基准,凡样品孔与阴性孔放射性之比大于的样品定为阳性
3、杂交瘤细胞的克隆化4从原始孔中得到的阳性杂交瘤细胞,可能来源于二个或者多个杂交瘤细胞,因此它们所分泌的抗体是不同质的为了得到彻底同质的单克隆抗体,必须对杂交瘤细胞进行克隆化另一方面,杂交瘤细胞培养的初期是不稳定的,有的细胞丢失部份染色体,可能丧失产生抗体的能力为了除去这部份已再也不分泌抗体的细胞,得到分泌抗体稳定的单克隆杂交瘤细胞系(又称亚克隆),也需要克隆化此外,长期液氮冻存的杂交瘤细胞,复苏后其分泌抗体的功能仍有可能丢失,因此也应作克隆化,以检测抗体分泌情况通常在得到针对预定抗原的杂交瘤以后需连续进行次克隆化,有时还需进行多次所谓克隆化是指使单个细胞无性繁殖而获得该细胞团体的整个培养过程克2-3隆化的方法不少,如有限稀释法、软琼脂法、单细胞显微操作法、单克隆细胞集团显微操作法和荧光激活细胞分类仪()分离法这FACS里介绍最简单也是使用最广泛的前两种方法
(1)有限稀释法材料、孔细胞培养板等;a
96、培养基;b HT、活力强的杂交瘤细胞;c、小鼠腹腔细胞d方法、制备小鼠腹腔细胞同细“胞融合一节中的方法a、制备待克隆的杂交瘤细胞悬液,用含血清的培养基稀释至每毫升含、和个细胞中不同的稀释度b20%HT
2.
515503、按每毫升加入细胞的比例,在上述杂交瘤细胞悬液中分别加入腹腔巨噬细胞c5x104-1x
105、每种杂交瘤细胞分装孔板一块,每一个稀释度孔,每孔量为每孔的杂交瘤细胞数分别为、和d
96320.2ml,
0.
5310、、湿润培养天,浮现肉眼可见的克隆即可检测抗体;在倒置显微镜下观察,标出惟独单个克隆生长的孔,取e37°C
7.5%CO27-10上清作抗体检测、取抗体检测阳性孔的细胞扩大培养,并冻存fg、本法中(b)、(c)、(d)也可简化为将计数后的杂交瘤细胞准确地进行系列稀释,直至每毫升含10个细胞,按每孔接种
0.1ml细胞悬液,即每孔含个细胞1
(2)软琼脂法材料、培养基(双倍浓度)a HT、用配制的琼脂糖称取细胞培养用琼脂糖,悬浮于⑵℃高压灭菌分钟,分装小瓶,b
0.15mol/LNaCl
2.0%
2.0g
0.15moi/LNaCl,1510ml冷却后保存4℃、小鼠腹腔细胞c、灭菌平皿d◊、水浴e45℃、活力很好的杂交瘤细胞f方法、在培养皿中制备饲养细胞(小鼠腹腔细胞)单层a、临用前将琼脂糖生理盐水溶液与等量双倍浓度的培养液混匀,配成琼脂糖培养液,水浴中温育b
2.0%HT1%45℃、吸去平皿上层培养液,加入琼脂糖培养液室温分钟c1%3ml,
10、取杂交瘤细胞悬液加入琼脂糖培养液混匀,铺于上层d1ml,1%1mle、37℃、
7.5%湿润培养7・14天;克隆生长至2mm时,用毛细吸管吸出克隆,直接转种于含有饲养细胞的24孔板,扩大培养、吸取上清,检测抗体,阳性孔可继续克隆化,或者扩大培养、冻存f、杂交瘤细胞的冻存与复苏5
(1)杂交瘤细胞的冻存在建立杂交瘤细胞的过程中,有时一次融合产生不少阳性孔,来不及对所有的杂交瘤细胞作进一步的工作,需要把其中一部份细胞冻存起来;另一方面,为了防止实验室可能发生的意外事故,如停电、污染、培养箱的温度或者控制器失灵等给正在建立中的杂交CO2瘤带来灾难,通常尽可能早地冻存一部份细胞作为种子,以免遭到不测在杂交瘤细胞建立以后,更需要冻存一大批,以备今后随时取用细胞冻存的原理是细胞在加血清和二甲基亚飒的培养基中以一定的缓慢速度下降温度(℃-20℃,每分钟下降1℃;-20℃-40C每分钟下降2℃),可在・196℃液氮或者液氮蒸气中长期保存下面介绍我们实验室的细胞冻存方法,经几年来对多种细胞的使用,细胞复苏存活率均在以上80%
①材料a、带盖吸管筒一只(铝质或者洋铁皮制),内壁(包括筒底和盖)衬1・2层石棉纸或者石棉布、含血清、的培养基,冰浴降温至摆布(用作冻存液)b10-20%5-10%DMSO HT0℃、灭菌安瓶或者带盖小瓶c、冰箱d-70C、液氮及液氮罐、处于对数生长中期、健康而活力好的杂交瘤细胞f
②方法、将杂交瘤细胞(或者其他细胞)离心,重新悬浮于预冷的冻存液中,浓度为摆布分装安瓶,每瓶置冰浴上;安瓶a106-107/ml,1ml,上标明细胞名称、冻存日期、批号等、安瓶封口后仍置冰浴上b、将安瓶放入一带收口绳的小布袋内,布袋上标明冻存号、细胞名称等,立即将布袋放入吸管筒内,置冰箱c-70℃、小时后或者过夜后从冰箱取出吸管筒,将盛有细胞的布袋移入液氮罐;在布袋的线绳上作好标记或者代码;最后在液氮d2-
4.70℃冻存簿上作详细记录、液氮罐应定期补充液氮(最好是专人管理);补充液氮及存取细胞时应带保护眼镜和手套,以免因液氮冻伤等e
(2)杂交瘤细胞的复苏杂交瘤细胞、骨髓瘤细胞或者其他细胞在液氮中保存,若无意外情况时,可保存数年至数十年复苏时融解细胞速度要快,使之迅速通过最易受损的以防细胞内形成冰晶引起细胞死亡-5℃0C,通常情况下,冻存时细胞数量多,生长状态好的杂交瘤细胞系以及其他细胞的复苏可采用以下方法,这也是各个实验室普遍采用的程序即复苏时,从液氮中取出安瓶,即将在℃水浴融化,待最后一点冰块快要融化时,从水浴中取出,置冰浴上用培养基375-lOmlHT稀释,l(XX)r/minlO分钟,弃上清,再悬浮于适量HT培养基中,转入培养瓶或者24孔板,置37°C,
7.5%CO2培养如果细胞存活力不高,死细胞太多,可加小鼠腹腔细胞进行培养104-105/ml无非,冻存的细胞并不都能复苏成功,其原因较多,如冻存时细胞数量少或者生长状态不良,或者复苏时培养条件改变或者方100%法不当,也可能细胞受细菌或者支原体污染,以及液氮罐保管不善等在浮现上述情况时,可采用一些补救方法复苏这些细胞,如小鼠皮下形成实体瘤法,脾内接种法,小鼠腹腔诱生腹水和实体瘤法,以及孔板培养法等
96、单抗特性的鉴定6
(1)单克隆性的确定包括杂交瘤细胞的染色体分析、单抗免疫球蛋白重链和轻链类型的鉴定和单抗纯度鉴定等
①杂交瘤细胞的染色体分析对杂交瘤细胞进行染色体分析可获得其是否是真正的杂交瘤细胞的客观指标之一,杂交瘤细胞的染色体数目应接近两种亲本细胞染色体数目的总和,正常小鼠脾细胞的染色体数目为40,小鼠骨髓瘤细胞SP2/0为62-68,NS-1为54-64;同时骨髓瘤细胞的染色体结构上反映两种亲本细胞的特点,除多数为端着丝点染色体外,还浮现少数标志染色体另一方面,杂交瘤细胞的染色体分析对了解杂交瘤分泌单抗的能力有一定的意义,普通来说,杂交瘤细胞染色体数目较多且较集中,其分泌能力则高,反之,其分泌单抗能力则低检查杂交瘤细胞染色体的方法最常用秋水仙素法,其原理是应用秋水仙素特异的破坏纺锤丝而获得中期分裂相细胞;再用溶液等低渗处理,使细胞膨胀,体积增大,染色体松散;经甲醇■冰醋酸溶液固定,即可观察检查其操作步骤如下
0.075mol/LKCl在加秋水仙素前小时将杂交瘤细胞传代a.48-36b.秋水仙素处理在培养瓶中加入秋水仙素(100ug/ml,除菌,-20℃保存),使最终浓度为
0.1・
0.4ug/ml(若改用秋水仙胺则最终浓度为
0.02-
0.05ug/ml);继续培养4-6小时,然后吹打细胞,移入离心管中,1000r/min10分钟,弃上清加入已预温到的溶液将沉淀细胞悬浮并混匀,水浴分钟c.37℃
0.075mol/LKCl5ml,37℃15-20d.向悬液中加入新配制的固定液(甲醇与冰醋酸31混合)1ml,混匀,然后1000r/min10分钟,弃去上清液;本步骤的目的是使细胞表面轻微固定,可防止固定后细胞粘连成团块e.加入固定液5ml,将细胞悬浮并混匀,室温静置20・30分钟,然后1000r/min10分钟,弃去上清液;重复操作一次;其后加5ml固定液,将细胞悬浮并混匀,封上管口,置过夜4℃£取出离心管,分钟,轻轻吸去上清液,根据细胞压积多少而留下固定液,将细胞悬浮并混匀后,吸取细胞悬液1000r/min
50.5-lml1-2滴,滴在刚从冰水中取出的载玻片上,用口吹散,并在火焰上通过数次,使细胞平铺于载玻片上,自然干燥g,用新配制的10%Giemsa染液染色020分钟,然后用自来水洗去染液,自然干燥(Giemsa染液配方Giemsa粉
0.5g,甘油33ml,55-60C保温小时,加甲醇混匀,保存于棕色瓶内作为原液;取原液份,力份,即成染液)233ml1Hl/15mol/L PH
6.8PBS910%Giemsa镜检选择染色体分散好,无重叠,无失散的细胞进行观察分析每份标本应计数个完整的中期核细胞,并注意观察是否有标h.100志染色体
②抗免疫球蛋白的类别和亚类鉴定抗体的类和亚类对决定提纯的方法有很大的匡助除采用特殊的免疫方法和检测方法,最时常得到的单抗是和分泌的IgM IgG,IgE杂交瘤细胞很少见,而分泌的杂交瘤通常惟独在用于融合的淋巴细胞来自肠道相关淋巴组织才干得到如在抗体检测中使用葡萄球菌IgA A蛋白试剂,则不可能得到以外的其他类的抗体鉴定单抗类和亚类的方法主要有两种,一种是免疫扩散,另一种是IgG IgELISA o()免疫扩散法A这种方法简便、准确,最常用被检的样品通常为杂交瘤细胞培养上清液,由于其中单抗的浓度较低,应先将其浓缩倍McAb10-20摆布再检测小鼠腹水中的单抗浓度虽很高,但也含有小鼠本身的各类它们也会与相应抗血清发生反应,使鉴定结果浮现混乱,即使将Ig,腹水稀释倍后再检测也不能彻底避免上述情况的发生,因此普通不用腹水型单抗作为被检样品10-20材料、小鼠及其亚类、、、和、的抗血清a IgGIgG1IgG2a IgG2b IgG3IgM IgA、巴比妥钠■盐酸缓冲液()b
0.06mol/L PH
8.
6、琼脂糖凝胶琼脂糖加入巴比妥钠-盐酸缓冲液中,隔水煮沸溶解,加防腐,保存备用c1%1g100ml
0.06ml/LPH
8.
60.02%NaN34℃d、洁净载玻片,打孔器(直径3mm),湿盒,酒精灯方法、杂交瘤细胞培养上清液的浓缩取该上清液装入透析袋中,用线扎紧,放在小烧杯中,透析袋周围堆置或者蔗糖a10ml PEG6000或者(聚乙烯毗咯烷酮放于数小时,待透析袋内液体量浓缩至约时,吸出,可于保存备用;也可采PVP polyvinylpynnlidonB4℃
0.5-1ml-20℃用吹风蒸发浓缩、加热溶化琼脂糖凝胶,铺制琼脂糖板,每片约b1%3ml、待琼脂凝固后,用打孔器在琼脂板上打出梅花形的小孔(中央孔,周围孔),然后封底c
16、向中央孔加入抗小鼠类或者亚类抗血清,周围孔加入待检样品;加样后将琼脂板放入湿盒,置水浴箱中小时或者d IgG37℃
12.244℃过夜,观察结果(B)ELISA法该法不需要将样品浓缩,而且比免疫扩散法更快地得到结果材料、所需用溶液同杂交瘤细胞的筛选一节a ELISA、酶标板b、山羊抗鼠但;兔抗小鼠类及亚类特异性血清;结合的山羊抗兔等c Ig HRP Ig、待检杂交瘤细胞培养上清;阴性、阳性对照样品d方法
一、每孔加入适量的山羊抗小鼠室温小时;洗涤液洗次a lOOul Ig,
22、每孔加封闭液,室温作用小时b
20031、洗涤液洗次;力口杂交瘤细胞培养上清,过夜;设阴性、阳性对照孔c21001114℃、洗涤次,每孔加兔抗小鼠类及亚类特异性抗血清,室温小时d4lOOulIg2e、洗涤4次,加lOOulHRP标记的山羊抗兔Ig;室温作用2小时、洗涤后,加底物显色,判读结果f、若有标记的抗小鼠类及亚类试剂,则可省去gHRPIg e方法
二、以适宜浓度的抗原包被酶标板,过夜a KXWL,4c、洗涤后,加入待检的单抗样品,孔,小时;设阴性、阳性对照孔b1003/37℃
1、洗涤后,加入标记的抗小鼠类及亚类的抗体试剂,孔,°避光显色分钟;用终止反应后,阅c HRPIg lOOul/37152moi/L H2so4读各孔的值OD
490、单抗纯度的鉴定C聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)、SDS-PAGE、等电点聚焦电泳(IEF)及免疫转印分析(WB)等方法都可用于鉴定单抗的纯度PAGE、、、的原理和方法请参阅有关专著,这里再也不赘述SDS-PAGE IEFWB
(1)单抗理化特性的鉴定从实用意义上说,单抗对温度和变化的敏感性以及单抗的亲合力都是理化特性鉴定的主要项目,它们可为单抗的使用和保存提供PH重要依据其中单抗亲合力测定比较复杂,下面作简要介绍抗体亲合力是指抗体与抗原或者半抗原结合的强度,其高低主要是由抗体和抗原份子的大小、抗体份子结合簇部和抗原决定簇之间的立体构型的合适程度决定的亲合力通常以平均内在结合常数表示K单抗亲合力测定是十分重要的,它可为正确选择不同用途的单抗提供依据在建立各种检测方法时,应选用高亲合力的单抗,以提高敏感性和特异性,并可节省试剂而在亲和层析时,应选用亲合力适中的单抗作为免疫吸附剂,因为亲合力过低不易吸附,亲合力过高不易洗脱精确测定单抗的亲合力是较艰难的,好在实际应用中选择单抗时,通常只需测定各单抗的相对亲合力及其高低罗列次序常用的方法有竞争、非竞争性、间接、间接法夹心等,这里仅介绍竞争性测定单抗亲和常数的方法其步骤是ELISA ELISA ELISA ELISAELISA取适宜浓度的纯化抗原包被酶标板,孔,过夜洗涤后,加入封闭液孔,小时取一定浓1003/4c
0.5%BSA-PBS,PH
7.21003/37℃1度的单抗,与系列倍比稀释的抗原混合,过夜,使反应达到平衡;必须注意所用抗原浓度至少要比抗体浓度高倍以上将平衡后的抗4℃10原抗体复合物加入酶标板孔中,孔,小时洗涤后,加入适宜稀释度的标记抗小鼠抗体,孔,小时洗涤100W37°C1HRP IgG100ul/37℃1后,加入底物溶液,孔,显色分钟;终止反应后,于波长测定各孔的吸收率按下列公式计算各OPD lXul/37c152moi/L H2so4495nm Ao单抗的亲和常数KAO/AO-A=l+K/aO其中人无抗原时值;人=采用不同浓度抗原时的值;抗原总量;二亲和常数0=A Aa0=K单抗与相应抗原的反应性测定2单抗与相应抗原的反应性决定于它所识别的抗原表位,确定单抗针对的表位在抗原结构上的位置,是单抗特性鉴定的关键环节,同时,进一步分析这种表位的差别,可正确评价单抗的特异性和交叉反应性,如一些抗原为同属不同血清型共有,甚至是科内不同属所共有,而另一些抗原表位则是某种血清型乃至某一菌株或者毒株所特有此外,单抗的反应性往往呈现一种或者几种免疫试验特异性,这在建株时予以测定,有利于正确使用这些单抗单抗反应性测定的方法不少,包括各类免疫血清学试验、生物学试验和免疫化学技术等,选择何种方法依据不同的单抗特性和试验目的而定,请参阅有关论著的详细论述疫动物但是,有时为了特殊目的而需进行种间杂交,则可免疫其他动物种间杂交瘤普通分泌抗体的能力不稳定,因为染色体容易丢失就小鼠而言,初次免疫时以周龄为宜,雌性鼠较便于操作8-12免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一,其目的在于使淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖,以利于细胞融3B合形成杂交细胞,并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会因此在设计免疫程序时,应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等没有一个免疫程序能合用于各种抗原现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法表列举了目前常用的免疫程序免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或者静脉注射,也采用足垫、6-1皮内、滴鼻或者点眼最后一次加强免疫多采用腹腔或者静脉注射,目前特别推崇后者,因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分在最后一次加强免疫后第天取脾融合为好,许多实验室的结果表明,初次免疫和再次免疫应答反应中,取脾细胞与骨髓瘤细胞融合,特异性3杂交瘤的形成高峰分别为第天和第天,在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌抗体,再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌422IgM IgG抗体笔者体味阳性杂交瘤浮现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系,且多在血清抗体高峰之前因此,为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞,这在最后一次加强免疫后第天取脾进行融合较适宜已有人报导采用脾内免疫,可提高小鼠对抗3原的免疫反应性,且节省时间,普通免疫天后即可融合
3、细胞融合2主要试剂的配制1
①细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有或者两种基础培养基,具RPMI-I640DMEMDulberco ModifiedEagles Medium体配制方法按厂家规定的程序,配好后过滤除菌
0.22um,分装,4℃保存不彻底培养基培养基原液RPML1640RPMI-164096ml溶液100XL.G.1ml双抗溶液1ml溶液
7.5%NaHCO3l-2ml溶液HEPES1ml不彻底培养基DMEM DMEM
13.37g超纯水或者四蒸水980mlNaHCO
33.7g双抗溶液10ml溶液100XL.G.10ml用调试至过滤除菌,分装保存IN H0PH
7.2-
7.44c彻底或者培养基不彻底或者培养基RPMI-1640DMEM RPMI-1640DMEM80ml小牛血清15-20ml用于骨髓瘤细胞和建株后的杂交瘤细胞培养SP2/0培养基彻底或者培养基HT RPMI-1640DMEM99ml贮存液HT1ml培养基彻底或者培养基HAT RPMI-1640DMEM98ml贮存液HT1ml贮存液A1ml
②氨基喋吟(A)贮存液(100x,4xlO-5mol/L)称取
1.76mg氨基喋吟(Aminopterin MW
440.4),溶于90ml超纯水或者四蒸水中,滴加lmol/L NaOH
0.5ml中和,再补加超纯水或者四蒸水至100ml过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),-20C保存
③次黄喋吟和胸腺喀咤核昔(HT)贮存液(100x,H10-2mol/L,T
1.6x10-3mol/L)称取
136.1mg次黄喋吟(Hypoxanthine,MW
136.1)和
38.8mg胸腺喀咤核昔(Thymidine,MW
242.2),加超纯水或者四蒸水至100ml,置45・50℃水浴中使彻底溶解,过滤除菌,分装小瓶(2ml/瓶),・20℃冻存用前可置37°C加温助溶
④L-谷氨酰胺(L.G.)溶液(100x,
0.2mol/L)称取
2.92gL-谷氨酰胺(L-glutamine,MW
146.15),用100ml不彻底培养液或者超纯水(或者四蒸水)溶解,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),冻存-20C
⑤青、链霉素(双抗)溶液(100x)取青霉素(钠盐)万单位和链霉素(硫酸盐)溶于灭菌超纯水或者四蒸水中,分装小瓶(瓶),冻存G1001g,100ml4-5ml/-20℃
⑥
7.5%NaHCO溶液3称取分析纯NaHCO
37.5g,溶于100ml超纯水或者四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),盖紧瓶塞,4℃保存
⑦HEPES溶液(1mol/L)称取
23.83g HEPES(N-2-Hydroxyethylpiperazine-N,-2-ethanesulft)nicac,油-2-羟乙基哌嗪-N,2乙基磺酸,MW
238.3)溶于100ml超纯水或者四蒸水中,过滤除菌,分装小瓶(4-5ml/瓶),4℃保存
⑧8-氮鸟喋吟贮存液(100x)称取200mg8■氮鸟懒令(8-azaguanine,MW
152.1),加入4moi/L NaOH1ml,待其溶解后,加入超纯水或者四蒸水99mL过滤除菌;分装小瓶,-20℃冻存使用时按1%浓度加入到培养液中(即终浓度为20ug/ml)
⑨50%PEG称取或者于三角瓶中,盖紧,水浴融化,分装于青霉素小瓶中,盖紧,磅高压蒸汽分钟,PEG1000400020■50g60-80C
0.6ml815-20℃存放备用临用前加热融化,加等量不彻底培养基,用少许调至或者购买或者公司现成产品
7.5%NaHCO3PH
8.0,Sigma Gibe
(2)髓瘤细胞的准备融合前骨髓瘤细胞维持的方式,对成功地得到杂交瘤是最为重要的目标是使细胞处于对数生长的时间尽可能长,融合前肯定不能少于周冻存的细胞在复苏后要周时间才干处于适合于融合的状态,长过了的骨髓瘤细胞至少几天才可能恢复在实验室中处于对数12生长的骨髓瘤细胞维持在含小牛血清的培养基中,方法是用个装培养基的培养瓶,接种倍系列稀释的骨髓瘤细胞周后到10%65ml101细胞相当密而又未长过的一瓶重新移植典型的倍增时间为小时14-16骨髓瘤细胞悬液的制备方法如下
①于融合前小时,将骨髓细胞扩大培养普通按一块孔板的融合试验约需瓶培养瓶培养的细胞进行准备48-36962-3100ml
②融合当天,用弯头滴管将细胞从瓶壁瘤轻轻吹下,采集于离心管或者融合管内50ml
③lXXr/min离心5-10分钟,弃去上清
④加入不彻底培养基,同法离心洗涤一次然后将细胞重悬浮于不彻底培养基,混匀30ml10ml
⑤取骨髓瘤细胞悬液,加台盼蓝染液作活细胞计数后备用细胞计数时,取细胞悬液加入台盼蓝染液中,混匀,用
0.4%
0.1ml
0.9ml血球计数板计数计算细胞数目的公式为每毫升细胞数=4个慷慨格细胞数X105/4;或者每毫升细胞数=5个中方格细胞数X106/2脾淋巴细胞的准备3取已经免疫的小鼠,摘除眼球采血,并分离血清作为抗体检测时的阳性对照血清同时通过颈脱位致死小鼠,浸泡于BALB/c75%酒精中分钟,于解剖台板上固定后掀开左侧腹部皮肤,可看到脾脏,换眼科剪镜,在超净台中用无菌手术剪剪开腹膜,取出脾脏置于已5盛有不彻底培养基的平皿中,轻轻洗涤,并细心剥去周围结缔组织将脾脏移入另一盛有不彻底培养基的平皿中,用弯头镜子10ml10ml或者装在注射器上的弯针头轻轻挤压脾脏也可用注射器内芯挤压脾脏,使脾细胞进入平皿中的不彻底培养基用吸管吹打数次,制1ml成单细胞悬液为了除去脾细胞悬液中的大团块,可用目铜网过滤收获脾细胞悬液,离心分钟,用不彻底培养基离心2001000r/min5-10洗涤次,然后将细胞重悬于不彻底培养基混匀,取上述悬液,加台酚蓝染液作活细胞计数后备用通常每只小鼠可得个1-210ml1x108-
2.5脾细胞,每只大鼠脾脏可得脾细胞5x1070x108饲养细胞的制备4Feeder cell9在细胞融合后选择性培养过程中,由于大量骨髓瘤细胞和脾细胞相继死亡,此时单个或者少数分散的杂交瘤细胞多半不易存活,通常必须加入其他活细胞使之繁殖,这种被加入的活细胞称为饲养细胞饲养细胞促进其他细胞增殖的机制尚不明了,普通认为它们可能释放非种属特异性的生长刺激因子,为杂交瘤细胞提供必要的生长条件;也可能是为了满足新生杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性常用的饲养细胞有胸腺细胞、正常脾细胞和腹腔巨噬细胞其中以小鼠腹腔巨噬细胞的来源及制备较为方便,且有吞噬清除死亡细胞及其碎片的作用,因此使用最为普遍其制备方法如下按上述采小鼠脾细胞的方法将小鼠致死、体表消毒和固定后,用消毒剪镜从后腹掀起腹部皮肤,暴露腹膜用酒精棉球擦拭腹膜消毒用注射器注射不彻底培养基至腹腔,注意避免穿入肠管右手固定注射器,使针头留置在腹腔内,左手持酒精棉球轻轻按摩腹部10ml分钟,随后吸出注入的培养液离心分钟,弃上清先用培养基将沉淀细胞悬浮,根据细胞计数结果,补加11000r/min5-105ml HATHAT培养基,使细胞浓度为备用通常对巨噬细胞来说,孔培养板每孔需个细胞,孔板每孔需细胞每只小鼠可得2xlO5/mL962x18241S3-5x18个细胞,因此一只小鼠可供两块孔板的饲养细胞也可在细胞融合前天制备并培养饲养细胞,这样使培养板孔底先铺上一层饲养细961-2胞层做法是,将上述细胞悬液加入孔板,每孔相当于滴,然后置的培养箱中培养
960.1ml237℃6%CO2细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养5细胞融合的程序已报导的有不少种,这里介绍的是作者所在实验室常用的一种
①W1X108脾细胞与2x107-5x107骨髓瘤细胞SP2/0-Agl4混合于一支50ml融合管中,补加不彻底培养基至30ml,充分混匀
②1000r/min离心5-10分钟,将上清尽量吸净
③在手掌上轻击融合管底,使沉淀细胞松散均匀;置水浴中预热40℃
④用吸管在分钟摆布最佳时间为秒加预热至℃的边加边轻轻搅拌1ml1454050%PEGPH
8.01ml,
⑤用吸管在秒内加预热至的不彻底培养基;静置分钟10ml902630ml37℃2637℃10分钟;弃去上清@1000r/min5
⑦加入培养基,轻轻吹吸沉淀细胞,使其悬浮并混匀,然后补加含腹腔巨噬细胞的培养基至5ml HATHAT80-100ml
⑧分装96孔细胞培养板,每孔;分装24孔板,每孔;然后将培养板置37℃,6%CO2培养箱内培养
⑨5天后用HAT培养基换出1/2培养基⑩
7.10天后用HT培养基换出HAT培养基;第14天后可用普通彻底培养基时常观察杂交瘤细胞生长情况,待其长至孔底面积1/10以上时吸出上清供抗体检测、杂交瘤细胞筛选3杂交瘤细胞在融合后周摆布即可筛选,即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来,通常也称为抗体检测抗体检测的方2法不少,通常根据所研究的抗原和实验室的条件而定但作为杂交瘤筛选的抗体检测方法必须具有快速、准备、简便,便于一次处理大量样品等特点因为往往有几百个样品需要在短短几个小时就报告结果,以便决定杂交瘤细胞的取舍所以选用抗体检测方法的原则是快速、敏感、特异、可靠、花费小和节省人力普通说来,在融合之前就必须建立好抗体检测方法,并克服可能存在的问题另一个重要问题是抗体检测方法所需要的动“力学范围”,即检出背景以上的最强与最弱信号之比,依所用的检测抗原是否纯净而定如杂交瘤抗体是针对纯化的蛋白质抗原的,的抗原参预反应,一个阳性/阴性判别系统就够了另一方面,如果杂交瘤抗体是针对细胞表面微量的蛋白抗100%原,检测系统可能需要能测出微弱信号,则动力学范围至少应为101,最好为1001此外,检测方法的选择还受所需杂交瘤抗体的类型和预定的用途的影响结合补体的抗体可以用基于细胞毒性反应的检测方法来选出如需结合蛋白的杂交瘤抗体,就要用结合蛋白的A A检测方法下面简要介绍几种常用的抗体检测方法免疫酶技术1免疫酶技术是将抗原抗体反应的特异性和酶对底物显色反应的高效催化作用有机结合而成的免疫学技术由于它特异性强,灵敏度高,现已广泛用于筛选和鉴定单抗
①器材和试剂、包被缓冲液a碳酸盐缓冲液取
0.2mol/L Na2c038ml,
0.2mol/L NaHCO17ml混合,再加75ml蒸储水,调PH至
9.
6.Tris・HQ缓冲液(PH
8.0,
0.02mol/L)i[X
0.1mol/L Tris100m,
10.1mol/L HC
158.4ml混合,加蒸储水至1000ml0b、洗涤缓冲液(PH
7.2的PBS)KH2Po40-2g,KC
10.2g,Na HPO
122.9g,NaCl
8.0g,Tween-
200.5ml,加蒸储水至1000ml o24c、稀释液和封闭液牛血清白蛋白(BSA)O.lg,加洗涤液至100ml;或者用洗涤液将小牛血清配成5-10%使用d、酶反应终止液(2mol/LH2so取蒸储水
178.3ml,滴加浓硫酸(98%)
21.7mle、底物缓冲液(PH
5.0,磷酸盐-柠檬酸缓冲液)iR
0.2mol/L Na.HPO
25.7ml,
0.1ml/L柠檬酸
24.3mL再加50ml蒸储水柠檬酸溶液及4配成的底物缓冲液不稳定,易形成沉淀,因此一次不宜配制过多、底物使用液f底物使用液(测的值)底物缓冲液OPD490nm ODOPD5mg,10ml,3%H
020.15ml或者底物使用液(测的值):或者()底物缓冲液TMBS TMB450nm ODTMBS TMBlmg/ml
1.0ml,10ml,1%H.0225uL底物使用液(测的值)底物缓冲液ABTS410nm ODABTS
0.5mg,1mL3%H O2ulo
22、抗体对照以骨髓瘤细胞培养上清作为阴性对照,以免疫鼠血清作为阳性血清g、抗原可溶性抗原尽量纯化,以获得高特异性h病毒感染的传代细胞或者全菌抗原淋巴细胞等悬液、酶标抗鼠抗体或者酶标或者其他类似试剂i SPAj、细胞固定液-20℃丙酮;或者丙酮•甲醛固定液NaHP0100mg,KH P0500mg,蒸储水150ml,丙酮225ml,甲醛125ml;或者丙酮.甲2424醛溶液(1;1);或者-20C甲醇、聚苯乙烯微孔板孔、孔、或者条孔;硬板或者软板均可使用k
4096、酶联免疫阅读仪;或者光镜
1、吸管、加样器及水浴箱、离心机等m
②可溶性抗原的酶联免疫吸附试验()ELISA、纯化抗原用包被液稀释至a l-20ug/mlo、以孔量加入酶标板孔中,置过夜或者吸附小时b50-1003/4c37℃2c、弃去孔内的液体,同时用洗涤液洗3次,每次3・5分钟,拍干、每孔加封闭液过夜或者封闭小时;该步骤对于一些抗原,可省略d20034℃37°C
2、洗涤液洗次;此时包被板可或者保存备用e3-20C4℃、每孔加待检杂交瘤细胞培养上清,同时设立阳性、阴性对照和空白对照;孵育小时;洗涤,拍干f50-100337℃1-
2、加酶标第二抗体,每孔孵育小时,洗涤,拍干g50-lOOul,37℃1-
2、加底物液,每孔加新鲜配制的底物使用液分钟h50-lOOuL37℃10-
30、以终止反应,在酶联免疫阅读仪上读取值i2moi/LH2sO4OD、结果判定以或者为阳性若阴性对照孔无色或者接近无色,阳性对照孔明确显色,则可直接用肉眼观察j P/N
2.1,PN+3D结果
③全菌抗原的ELISAS、新鲜培养的细菌用蒸储水或者悬浮,并调整细菌浓度至个必须指出,对于人畜共患病病原体需注意安全操作,a PBS1x108/ml最好是灭活处理b、每孔中加10035%戊二醛溶液(
0.1mol/LNaHCO395ml+25%戊二醛溶液5ml),37℃作用2小时,蒸储水洗涤3次;加之述细菌悬液孔;烘干;每孔加封闭液过夜或者小时封闭50ul/37-56℃200ul4℃37℃
2、步骤也可采用先每孔加细菌悬液,烘干,然后用预冷的无水甲醇室温作用分钟,蒸储水洗涤次;每孔c b50ul37℃-56℃-20℃153加封闭液过夜或者小时封闭200ul4℃37℃
2、洗涤液洗次;此时包被板可在或者保存备用d3-20℃4c、以下步骤同上法e
④用全细胞抗原的ELISA、按常规方法培养细胞,接种病毒,收获感染细胞和未感染细胞,进行细胞计数,用制成适当浓度悬液a PBS、淋巴细胞悬液的制备采用新鲜外周血加肝素抗凝后,滴加于淋巴细胞分离液之上,「离心分钟,吸取界面细胞洗涤二b1500pm30次,即为新鲜淋巴细胞悬液该细胞悬液中若仍混有红细胞,离心后加的氯化钱溶液,室温分钟,洗涤一次即可将该细胞悬液
0.83%10稀释至适当浓度、每孔加上述或者的细胞悬液,使每孔含细胞伊个;分钟,甩去上清;室温干燥或者吹干后用丙酮-甲醇c100ul ab5x11500r/min15
(11)4℃固定10分钟;可4℃或者-20℃保存备用、以下步骤同上法d
⑤抗体捕捉试验ELISA本法用抗小鼠的多克隆抗体捕捉待检样品中的再挨次加抗原、酶标多克隆抗体及底物显色该法是常用的BALB/c IgMcAb,ELISA中较理想的一种;其操作步骤如下、以适当浓度的纯化抗鼠抗体包被酶标板,每孔加此小时或者过夜a Ig10037℃24℃b、洗涤、拍干后加待测的McAb样品,37℃1・2小时、洗涤后加适量的抗原,c37℃1-2Wo、洗涤后加入酶标多克隆抗体,小时洗涤后加底物显色,判定结果d37cl-2
⑥ABC-ELISA试验是在常规原理的基础上,增加了生物素与亲和素间的放大作用亲和素有个亚单位组成,对生物ABC-ELISAELISABiotiri Avidin4素有高度的亲合力生物素很易与蛋白质共价结合因此,结合了酶的亲和素与结合有抗体的生物素发生反应即起到了多极放大作用其操作步骤如下、已知抗原的包被及加待检样品,同间接试验°a McAbELISA、加生物素化抗鼠抗体,每孔小时;洗涤b Ig1X3,37℃
1、加酶标亲和素,每孔分钟洗涤;加底物显色,判定结果c100uL37℃30
⑦Dot-ELISA试验免疫斑点试验是以硝酸纤维素膜或者醋酸纤维素膜为固相载体,进行抗原抗体反应的免疫检测手段该法采用不溶性Dot-ELISA底物如或者-氯蔡酚或者等,其与相应标记物、、胶体金作用形成不溶性产物,呈现斑点状着色,从而易于判定DAB,4AgNO3HRP AP结果根据所用的标记物不同,可分为免疫斑点试验、免疫斑点试验和免疫金银斑点法等其操作步骤大致如下HRP APa、将抗原液2・5ul点加于纤维素膜上,室温37℃干燥、将纤维膜浸入封闭液中,分钟b37℃
30、用洗涤液洗次,吸干后加待检样品,小时;用洗涤液振荡洗涤三次,每次分钟,加或者或者胶体金标记c2McAb37C15HRP AP的抗鼠抗体,作用分钟Ig37℃
30、同法洗涤,吸干,用新配的相应底物溶液显色,然后水洗终止反应,观察结果d
⑧免疫组化染色法该法主要用于检测针对细胞抗原成份的常用的方法是间接免疫过氧化物酶试验及技术McAb,IIP,indirect immunoperoxidasG APAAP其结果用光镜或者倒置显微镜检查免疫荧光技术2免疫荧光技术可用于多种抗原的杂交瘤抗体检测,如细胞性抗原包括细菌和动物细胞、感染细胞中的病毒抗原和膜抗原等其操作简单、敏感性高,可直接观察抗原定位等优点,在的筛选与鉴定上具有重要的应用价值McAb
①器材和试剂、供检测抗体用的抗原制备固定细胞片或者板,活细胞悬液a、b PBSPH
7.2,
0.01mol/L、待检的样品c McAb、冷丙酮d、(异硫氧酸荧光素)或者(四甲基异硫鼠酸罗丹明荧光素)标记的抗鼠抗体等e FITCTRITC1g、荧光显微镜,磁力搅拌器,离心机,水浴箱等f
②间接免疫荧光法、固定细胞片的制备生长在盖片上的细胞(接种或者未接种病毒),可直接收获盖片,在中洗涤,用丙酮固定分钟,a PBS4c10空气干燥,置密封容器于保存备用;单细胞悬液可在盖片上制成涂片,固定方法同上-20℃细胞涂片的制备将103细菌悬液(1x108个/ml)涂抹7x21mm盖片上,自然干燥后,用-20℃丙酮固定10-15分钟,于・20℃保存备用、盖片在去离子水中湿润后置架上滴加杂交瘤上清或者其他待检样品;设立阳性、阴性对照;置水浴孵育小时b10-20337℃
0.5-
1、取出盖片置中用磁力搅拌器洗涤分钟c PBS
15、盖片置架上,滴加工作浓度的抗鼠的荧光抗体℃孵育小时d Ig10-203,
370.5-1e、同法洗涤15分钟;取出盖片,用延缓荧光碎灭的封载剂(如缓冲甘油,9份甘油加1份PBS)封于干净载玻片上f、光显微镜上观察,阳性结果可见特异性荧光(FITC为黄绿色荧光,TRITC为桔红色荧光)、细胞固定片的制备,也可改在培养板孔中进行,其余步骤同上,在观察结果时,将培养板翻转置于荧光显微镜下,判断标准不变g
③细胞的膜荧光染色完整的活细胞的细胞膜,抗体不能透过如果细胞在操作,则荧光染色仅限于细胞膜必须注意死细胞常以非特异性方式吸附4℃大量荧光抗体,因此试验过程中要保证细胞的高活力活细胞的膜荧光染色大致步骤如下、制备活性较好的细胞悬液,调节浓度至个a107/ml、在小试管()中加入细胞悬液,再加入待检的样品,混匀,作用分钟b5x50mm100ul lOOulMcAb4c30-90c、用洗涤液(PBS900ml,小牛血清50m1,4%NaN50m1)洗二次,每次加洗涤液lOOOr/min离心5分钟,弃上清加入1(X)ul荧光抗体,4℃作用30-9()分钟、同法洗涤,将细胞重新悬于含甘油和苯二胺的溶液中;滴加于载玻片上,加盖片封载d20-30U110%10-lOOug/ml、即将在荧光显微镜上检查e、细胞也可在染色后用多聚甲醛生理盐水固定,即将检查,或者至少在可保存一周f1%4c
(3)1诃接血凝试验间接血凝试验又称被动血凝试验(),是目前应用较广的检测方法之一本试验是以包被可溶性抗原的红细胞作为指示系统,PHA当被检抗体与包被在红细胞上的抗原产生特异性反应时,导致红细胞呈凝集现象可见,该法具有灵敏、快速、容易操作和无需昂贵仪器等优点,而且经改用醛化红细胞以后,克服原来重复性差的缺点。