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文本内容:
植物硝酸还原酶()活力测定(活体法)NR于图
一、原理硝酸还原酶(NR)是植物氮素同化的关键酶,它催化植物体内的硝酸盐还原为亚硝酸盐,产生的亚硝酸盐与对-氨基苯磺酸(或对-氨基苯磺酰胺)及蔡胺(或蔡基乙烯二胺)在酸性条件下定量生成红色偶氮化合物其反应如下生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰,可用分光光度法测定硝酸还原酶活性可由产生的亚硝态氮的量表示一般以NpggLh-i为单位NR的测定可分为活体C1-N=N法和离体法活体法步骤简单,适合快速、多组测定离体法复杂,但重复性较好、+-N02-+2H+Cl+2HQ
二、仪器与用具SO3HCI-N=N+分光光度计;真空抽气泵(或20ml注射器筒);天平;单面刀片呆温箱(或恒温水浴;刻度试管15ml;移液管5mlx2,2m1x8,lmlx2\2SO3H NH
三、试剂
1.亚硝酸钠标准液称取分析纯NaNO
0.1000g水溶后定容至100ml,吸取5ml用水稀2释定容至1000ml,即为每ml含NaNO5pg亚硝态氮近似lpg/ml的标准液
22.
0.1mol/L pH
7.5的磷酸缓冲液:K2HPO
419.24g,KH2Po
42.2g,加水溶解后定容至1000mL对-氨基苯磺酸溶液称取加入浓中,用蒸储水定容
3.1%W/V
10.0g250ml HCI至1000mL
4.
0.2%W/Va-秦胺溶液称取
2.0ga-蔡胺溶于250ml冰醋酸中,用蒸储水定容至1000mL
5.30%三氯乙酸溶液
75.0g三氯乙酸水溶后定容250mlo
6.KNO
0.1mol/L\异丙醇1%V/V\磷酸缓冲液
0.1mol/L混合液称
10.10g KNO33溶于1000ml
0.1mol/L的磷酸缓冲液中,再加10ml异丙醇混匀
四、方法
1.标准曲线制作取7支洁净烘干的15ml刻度试管按表13-1顺序加试剂,即配成0-
2.0|jg的系列标准℃亚硝态氮溶液摇匀后在保温箱或恒温水浴中保温,然后在波长下3030min540nm比色以亚硝态氮pg为横坐标,光密度值为纵坐标绘标准曲线或建立回归方程表13-1各试剂加入顺序年号1■■6哈螂的标腕
002040.1U
1.
62.0•
42.
0111.6U
0.1;0IX对-冢基茉谓酸44444444444444每旧二州
00.
20.
40.S1J
1.
62.
02.酶反应和酶活性测定取样将材料小麦、玉米等作物叶片洗净,用蒸储水冲洗,滤纸吸干在叶片中1部打取直径1cm的圆片或剪成
0.5~
1.0cm2的小块,混匀后每个样品称
0.3g3份,放入试管并编号2反应向各试管加入KNO3•异丙醇•磷酸缓冲液混合液9ml,其中一管立即加
1.0ml三氯乙酸混匀作对照然后将所有试管置真空干燥器中接真空泵抽气,反复几次直至叶片沉℃在管底将各试管置30下于黑暗处保温30min,分别向处理管加
1.0ml三氯乙酸,摇匀终止酶活性3比色将各试管静置2min,吸取上清液2ml加入另一组试管,以对照管做参比,按标准曲线做法进行显色测定,并计算酶活性Npg-g i-h-i X样品中酶活性1ng•g■•■h-=~@xt-式中:反应液催化产生的亚硝态氮总量(用);c(VI:反应液总体积ml);V2:反应时加入的提取液体积(ml);)\/\/:样品重量(9;t:反应时间(h\。