构建点突变质粒步骤

基因定点突变

一、定点突变的目的把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基

二、定点突变的原理通过设计引物，并利用将模板扩增出来，然后去掉模板，剩下来的就是我们的产PCR PCR物，在产物上就已经把这个点变过来了，然后再转化，筛选阳性克隆，再测序确定就行了PCR

三、引物设计原则引物设计的一般原则不再重复突变引物设计的特殊原则

（1）通常引物长度为25〜45bp,我们建议引物长度为30-35bp一般都是以要突变的碱基o为中心，加上两边的一段序列，两边长度至少为若两边引物太短了，很可能会造成11-12bp突变实验失败，因为引物至少要个才能与模板搭上，而这种突变要求两边都能11-12bp PCR与引物搭上，所以两边最好各设至少个并且合成多一条反向互补的引物12bp,（）如果设定的引物长度为接下来需要计算引物的值，看是否达到℃（230bp,Tm78GC含量应大于）40%o（）如果值低于℃则适当改变引物的长度以使其值达到（含量应大3Tm78,Tm78c GC于）40%o（）设计上下游引物时确保突变点在引物的中央位置4（）最好使用经过纯化的引物5值计算公式（）Tm Tm=

0.41x%of GC-675/L+

81.5注引物碱基数；引物含量L%of GCGC

四、引物设计实例以为例GCG-ACG5,-CCTCCTTCAGTATGTAGGCGACTTACTTATTGCGG-3,（）首先设计长的上下游引物，并将（）设计在引物的中央位置130bp ATPrimer#1:5,-CCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGC-3,Primer#2:5-GCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGG-3（）引物含量为为将这两个数值带入值计算公式，得到其2GC40%,L30,Tm Tm=

75.5（）通过计算可以看出其低于℃这样的引物是不合适的，所Tm=

0.41x40-675/30+

81.5Tm78,o以必须调整引物长度（）重新调整引物长度3Primer#1:5,-CCTCCTTCAGTATGTAGACGACTTACTTATTGCGG-3,Primer#2:5-CCGCAATAAGTAAGTCGTCTACATACTGAAGGAGG-3在引物两端加（斜体下划线处），这样引物的含量为值为将这两个5mer GC

45.7%,L35,数值带入值计算公式，得到其为（）这样的引物就Tm Tm

80.952Tm=

0.41x

47.5-675/35+

81.5,可以用于突变实验了

五、突变所用聚合酶及Buffer引物和质粒都准备好后，当然就是做喽，不过对于的酶和不能用平时的，PCR PCRbuffer,我们做把整个质粒扩出来，延伸长度达到几个所以要用那些或扩增长片段的PCR K,GC buffer另外，要用保真性能较好的酶来扩增，防止引进新的突变buffer,PFU除了使用基因定点突变试剂盒，如和塞百盛的试剂盒，但价格昂贵可以使用Stratagene高保真的聚合酶，如博大泰克的金牌快速酶、的taq TakaraPrimeSTAR™HS DNApolymeraseo

六、如何去掉产物PCR最简单的方法就是用酶，能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用的模板一般都Dpnl Dpnl是双链超螺旋质粒，从大肠杆菌里提出来的质粒一般都被甲基化保护起来（除非你用的是甲基化缺陷型的菌株），而产物都是没有甲基化的，所以酶能够特异性地切割模板（质PCR Dpnl粒）而不会影响产物，从而去掉模板留下产物，所以提质粒时那些菌株一定不能是PCR PCR甲基化缺陷株处理的时间最好长一点，最少一个小时吧，最好能有两三个小时，因为如果模板处理Dpnl得不干净，哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来，就会导致实验失败

七、如何拿到质粒直接把通过处理的产物拿去做转化就行了，然后再筛选出阳性克隆，并提出质Dpnl PCR粒，拿去测序，验证突变结果

八、图示PCR amplifiedStep

1.Inducing mutation「•PCR eocHon•Using Muta-dire el™Step

2.Selection■Using MutazymDigestedby•Mutazyme*Not transformed$tep

3.Transformation■Uslrvg compotontc^l Nickrecovering

九、定点突变操作步骤［］诱导突变基因（反应）以待突变的质粒为模板，用设计的引物及酶进A PCRMuta-directTM行扩增反应，诱导目的基因突变PCR.设计点突变引物1［注］参考引物设计指导准备模板质粒

2.DN A［注］用型菌株（例如菌株）作为宿主菌在型菌株中常有克隆数低的现象，但是对突变效率dam+DH5a end+没有影响提取质粒时我们建议您使用本公司的质粒提纯试剂盒DNA.［选项］对照反应体系（口反应体系）35010x ReactionBuffer5|ilpUC18control plasmid10ng/|il,total20ng2ilControl primermix20pmol/|il2ildNTP mixture each

2.5mM2|il用dH O382Muta-direct™Enzyme l|il.样品反应体系（可反应体系）45010x ReactionBuffer5|ilSample plasmidlOng/gl,total20ng2plSample primerF10pmol/|il l|ilSample primerR10pmol/|il ijildNTPmixtureeach

2.5mM2gldWO38pilMuta-direct™Enzyme1pl反应条件

5.PCR［注］按如下参数设置扩增条件PCRCycles TemperatureReaction Time℃1cycle9530sec℃15cycle9530sec℃551min℃721min perplasmid Kb扩增反应完成后冰育分钟，然后置于室温（避免反复冻融）

6.PCR5［注］按下列提供的条件进行扩增，控制循环数注意当突变点位点超过个时会发生突变率降PCR PCR4低的现象Mutation Cycles1~2Nucleotide15cycles3Nucleotides18cycles［］突变质粒选择B反应结束后使用酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒PCR MutazymeTMDNA准备反应产物

1.PCR加入（（）酶℃温育小时

2.l|il10U/il MutazymeTM371［注］当质粒用量过多时酶可能发生与样品反应不完全的现象因此我们建议为了保证突变DNA MutazymeTM率请严格遵照实验步骤进行操作如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加酶用量MutazymeTM［］转化C反应完毕后在质粒上会产生缺口，当把这个质粒转入中时请选择型DNA DNAE.coli dam+菌株，例如DH5ao

1.将10|11样品加到50gl感受态细胞里，然后放置在冰上30分钟接下来可以参照一般的转化步骤进行

2.序列分析通常当平板上出白色菌落则表明发生了突变LB为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。