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多点法制备适当的高、中、低三水平浓度的待测物对照品溶液和参比物对照品溶液,如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用,则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度,分别注入液相色谱仪进样测定,按照公式工计算得到多个校正因子值,求取平均值作为校正因子目前该测定方法在中药多指标对照品替代测定中应用较为广泛,但在杂质含量确定方面应用较少标准曲线法目前,校正因子的测定最常用的方法还是标准曲线测定法具体操作如下精密称取待测物对照品和参比物对照品各适量,分别配制成不同浓度的系列溶液,如果是加校正因子的主成分自身对照法计算杂质含量用,则建议待测物和参比物浓度涵盖定量限和标准限度,分别注入液相色谱仪进样测定,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,分别绘制参比物c A和待测物标准曲线当时,可以推导出两者的相对校正因子为二者斜率之比,即公A=kc+b,b=0k式2f=k参比物/%待测物2其中分别为参比物和待测物标准曲线的斜率k联立方程法前述种方法使用的前提就是待测物和参比物最好备有色谱纯的化学试剂或标准物质,即3HPLC使没有色谱纯,也要确知物质的百分含量但在药物研发的早期,很难得到已知杂质的纯品,因此,提出了一种无纯样色谱校正因子的测定方法Yu根据校正因子与峰面积成正比校正因子是常数的条件的前提,设一“标”样仅含、二组A B分且都出峰,各组分的量之和为一定值如、两组分含量之和为因而可建立各组分的A B100%,量之和与校正因子、峰面积三者之关联式,另一“标”样亦仅含、二组分,但峰面积有差A B异即二组分含量有异,同样可建立三者关联式,解两个关联式即可得各组分校正因子由此推论有几个组分就要建立相应个数的关联式求解而得到各组分的校正因子该方法为早期检测研发中带有多个未知校正因子组分的样品提供了一个新的解决思路,但是受早期研发样品中可能还含有很多未知杂质等因素的限制,目前可以检索到该方法的实际应用较少紫外吸光系数比值法结合文献,等首次推导出了公式证明了两物质的相对校正因子是两者的百分吸光系数Xu3,E之比E/=E待测物/参比物⑶因此可按吸光系数测定的相关技术要求,如对照品级别的标准物质、高中低三水平浓度测定、吸光度介于之间、至少台不同型号的分光光度计、份供试液同时平行制备测定、
0.3〜
0.85UV2同台仪器份供试液的平行测定结果不超过等,以流动相为溶剂,测定待测物和参比物在2±
0.5%检测波长处的紫外吸收系数计算比值,求得校正因子El%lcm,联用其他方法HPLC串联其他检测器方法HPLC-UV/PDA为解决检测器方法有时很难获得待测物和参比物标准物质的难题,有研究者提出HPLC-UV/PDA通用型质量检测器技术与或检测器串联以确定校正因子的方法这种通用型质量检测PDA UV器产生的峰面积与相应的进入检测器的分析物的量成正比关系,而与分析物的结构特性无关,从而可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系,再结合检测器得到的UV/PDA峰面积,由公式可推导出待测物相对于参比物的校正因子,如公式所示14A/Af_八待测物UV峰面积待测物质址型检测器峰面积4J—4/A八参比物UV嶂面积参比物质员型检测器峰面积在药物早期研发过程中使用此方法可以快速方便的测定特定杂质的相对响应因子,不需要进行杂质的分离纯化,也不需要杂质标准品,甚至可以不需要知道分析物的浓度目前可与紫外检测器串联测定相对校正因子的通用型质量检测器主要有蒸发光散射检测器、电喷雾检测器、化学发光氮检测器、示差折光检测器等其中、ELSD CADCLND RIELSD CAD,其检测的峰面积与进入检测器的分析物的质量成正比关系;检测的峰面积与分析物中含氮CLND的摩尔数成正比关系通过这些信息可以得出进入检测器中的待测物与参比物的相对数量关系,再结合紫外吸收检测器得到的待测物与参比物峰面积,可计算出特定杂质相对于参比物的校正因子目前仅检索到国外的相关研究工作,未见国内相关报道检测器结合核磁定量方法HPLC-UV/PDA虽然紫外检测器与通用型质量检测器串联的法在测定杂质相对校正因子时方便、快速,但HPLC这些通用型的质量检测器都各有局限性如受精密度、线性动态范围、需要挥发性流动相等因素的局限,且的响应取决于探ELSD ELSD测器中发生的去溶剂化过程所产生的粒子的数量和性质;只能测定含氮化合物,但不能够CLND测定结构中包含一二一和一结构的化合物,也不能够用含氮的流动相、流动相中N NN—N—不能有非挥发性的缓冲盐;的流动相中也不能有非挥发性的缓冲盐,而且只适用于在电喷CAD雾电离条件下能够携带电荷的化合物,受灵敏度、重现性等问题限制且不能用于梯度洗脱RI除具备检测器串联法的优点外,不受上述检测器的流动相、缓冲液等色谱条件的限NMR HPLC制,检测的峰面积与分析物中相应的氢的摩尔数成正比关系,可以作为含有质子的化q-lH-NMR合物测定相对校正因子的通用质量型检测器,但前提是该化合物可溶解在合适的笊代溶剂中于是等建立了与结合的方法测定特定杂质的相对响应因子的Webster HPLC-UV q-lH-NMR RRF方法检测的峰面积与分析物中相应的氢的摩尔数成正比关系,所以相对响应因子的计算公1H-NMR式如下uv rNMRr参比物待测物参比物待测物RRFUV=r待测物rNMRNH参比物,待测物Z叁比物其中为紫外检测器的相应峰面积;为谱图中相应氢的积分值;为相对分子AUV INMRNMR Mr质量;为化合物结构中用于积分计算的相应的氢的个数NH。