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文本内容:
法使用步骤Trizol
一、分离纯化的基本原理研究基因的表达和调控时常常要从组织和细胞中分离和纯化质量的高低常常影响RNAo RNA库,和等分子生物学实验的成败是一种新型总抽提试剂,cDNA RT-PCR NorthernBlot TrizolRNA内含异硫氧酸胭等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶
二、用户需自备的试剂和材料无水乙醇、氯仿、(可能需要)、管()>Glycogen
1.5ml EppendorfRNase-free()Tips RNase-free
三、准备工作酶非常稳定,是导致降解最主要的物质它在一些极端的条件可以暂时失活,但RNase RNA限制因素去除后有迅速复性用常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能是完RNase全失活它广泛存在于人的皮肤上,因此,在与制备有关的分子生物学实验时,必须戴手RNA套的又一污染源是取液器,根据取液器制造商的要求对取液器进行处理一般情况下采用RNase用配制的乙醇擦洗取液器的内部和外部,基本达到要求取的物品时必须DEPC70%RNase-free戴手套、料制品的处理1尽可能使用无菌,一次性塑料制品,已标明的塑料制品,如没有开封使用过通常没RNase-Free有必要再次处理对于国产塑料制品,原则上都必须处理方可使用处理步骤如下)在玻璃烧杯中注入去离子水,加入使的终浓度为注意为剧毒物,1DEPC DEPC
0.1%DEPC活性很强,小心在通风柜中使用)2处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入水溶液,使塑料制品的所有部分都DEPC浸泡到溶液中)在通风柜中室温处理过夜)将水溶液小心倒到废液瓶中,用铝箔34DEPC封住含已水处理过的塑料制品的烧杯,高温高压蒸气灭菌至少分钟DEPC30)烘箱用合适的温度烘拷至干燥置于干净处备用
5、璃玻和金属物品2烘烤小时以上250°C3
四、从组织中提取总RNA)液氮研磨组织块直接放入研钵中,加入少量液氮,迅速研磨,待组织变软,再加少量液氮,1再研磨,如此三次,按组织加入转入离心管进行第步操作50-100mg/ml Trizol Trizol,2)匀浆组织样品按加入另外,组织体积不能超过体积的250-100mg/mlTrizol TrizolTrizol10%,否则匀浆效果会不好,用电动匀浆器充分匀浆约需分钟1-2
五、从细胞中提取总RNA)培养贴壁细胞不须消化,可直接用进行消化、裂解,体积按比例加1TrizolTrizol10cm2/ml入)悬浮细胞可直接收集、裂解,每可裂解动物、植物或酵母细胞,或细21ml Trizol5X106107菌细胞
六、操作步骤、细胞或组织加后,室温放置使其充分裂解注此时可放入长期保持1Trizol5min,-70C、离心弃沉淀212,000rpm5min,、按氯仿加入氯仿,振荡混匀后室温放置注禁用漩涡振荡器,以免基32003/ml Trizol15mino因组断裂DNA、℃离心4412,000g15mino、吸取上层水相,至另一离心管中注千万不要吸取中间界面;若同时提取和蛋白质,5DNA则保留下层酚相存于℃冰箱,若只提则弃下层酚相4RNA,、按异丙醇加入异丙醇混匀,室温放置
60.5ml/ml Trizol5-10min
7、4℃12,000g离心10min,弃上清,RNA沉于管底、按乙醇加入乙醇,温和振荡离心管,悬浮沉淀81ml75%/ml Trizol75%、℃离心尽量弃上清948,000g5min,、室温晾干或真空干燥注样品不要过于干燥,否则很难溶解105-10mino RNA、可用或溶解样品,℃注、或1150ul H20,TE buffer
0.5%SDS RNA55-60,5-10mino H20TE
0.5%SDS均须用处理并高压DEPC、测值定量浓度注此方法提取值在之间;产率估计组
120.D RNARNA A260/A280L6-
1.8织标本(组织)培养细胞()注组织或细胞量过ugRNA/mg l-10ug,ugRNA/106Cell5-15ugo少,可酌情减少用量;组织或细胞用量过多,会引起对的污染;Trizol DNARNA高蛋白、脂肪或多糖类组织,肌肉组织或块状植物组织等,组织匀浆或液氮研磨后须℃412,000g离心去掉不溶物,再进行下面操作,若顶层有脂肪物,则也须去掉;10min热天提带手套是必须的,手是的主要来源;RNA,RNase组织块用液氮研磨,效果最好,若没有液氮或电动匀浆器,可用手动匀浆器代替,此时组织块不宜过大,且需先用眼科剪刀将组织碱碱剪碎,然后再充分研磨肝脏、肠道、肌肉总提取方法
6.
1.
2.1RNA
①使用已高温蒸汽灭菌的手术刀和镶子从鱼的腹部解剖开,从中取出完整的肝脏、肠、肌肉等组织,置于离心管后立即放入液氮中;
②组织在液氮下研磨成粉,取少量至加有的离心管中,充分混合后于℃ImLTrizol L5ml4,离心;12,000rpm15min
③取上清移至新离心管中,加入氯仿,剧烈震荡直至呈乳白色,于℃
1.5ml20034,离心;12,000rpm15min
④取上清移至新离心管中,加入异丙醇,轻轻颠倒次,冰上放置于℃
1.5ml50031020mins,4,离心;12,000rpm15min
⑤弃上清,加入乙醇用水现配现用,于℃离心重复此步骤一lml75%DEPC4,12000rpm5min,次;
⑥弃上清后,室温干燥;5-7mins
⑦加入适量的水溶解沉淀℃溶解,最好℃保存,检测浓度,并20-30ul DEPC65-20C-80RNA电泳检测浓度测定和电泳检测
6.
1.
2.2RNA取提取好的溶液,于测定浓度及2ul RNANanodrop2000Spectrophptpmeter RNA A260/A280的相对吸光度,纯净的应在之间RNAA260/A280A8-
2.2电泳检测琼脂糖,缓冲液,电泳凝胶成像系统观察,分析结果1%1XATE90V30min,脏、肌肉、肠道样品的合成
6.
1.
2.3cDNA反应按照公司的反TaKaRa PrimeScriptrRT reagentKit WithgDNA EraserPerfect RealTime转录试剂盒说明书进行,合成模板cDNA
①基因组的除去反应,在管中配置如下缓冲液DNA PCR试齐」I用量5X gDNAEraser Buffer
2.0ulgDNA Eraser
1.0u ITotalRNAX*ulRNase FreedH2Oup to10u I根据检测到的浓度来配置;X*RNA混合均匀后,室温放置20-30min
②反转录反应,在管中配置如下缓冲液反应液配制在冰上进行为了保证反PCR20ul system,应液配制的准确性,进行各项反应时,先按反应数的量配制,然后再分装到每个+1Master Mix反应管中试剂使用量5X PrimeScriptrBuffer2for RealTime
4.0ulPrimeScriptr RTEnzyme MixI
1.0ulRT PrimerMix
1.0Rl
①的反应液
10.0ulRNase FreedH2Oup to20u I
③混合均匀后,在仪上进行逆转录反应,反应条件为PCR℃3715min℃855sec然后将得到的存放于冰箱保存待用cDNA-20C。