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文本内容:
②
0.5mol/L乙二胺四乙酸pH
8.0EDTA:配制等摩尔的Na2EDTA和NaOII溶液
0.5mol/L,混合后形成EDTA的三钠盐或称取
9.31g的Na2EDTA•2H20和1g的NaOH,pH调至
8.0,并溶于约401nl水中,定容至50ml
③3mol/L乙酸钠pH
5.2Sodium acetate溶解
20.4g的三水乙酸钠于约40ml水中,用冰乙酸调溶液的pH至
5.2,再加水定容到50ml;
④2%十二烷基硫酸钠SDS称取IgSDS慢慢转移到约含40ml的水的烧杯中,用磁力搅拌器搅拌直至完全溶解用水定容至50ml;
⑤40%氢氧化钠NaOH溶解40g氢氧化钠颗粒于约90ml水的烧杯中磁力搅拌器搅拌,氢氧化钠完全溶解后用水定容至100ml o
⑥lmol/L盐酸HC1加
8.6ml的浓盐酸至
91.4ml的水中710mg/ml蛋白酶K proteinaseK将100mg的蛋白酶k加入到
9.5ml水中,轻轻摇动,直至蛋白酶K完全溶解不要涡旋混合加水定容到10ml,然后分装成小份贮存于-20℃lOmg/mlRnase无DNase DNase—free RNase即无DNA酶的核糖核酸酶8溶解10mg的胰蛋白RNA酶于1ml的10mmol/L的乙酸钠水溶液中pH
5.0溶解后于水浴中煮沸15min,使DNA酶失活用lmol/L的Tris—HC1调pH至
7.5,于-20℃贮存配制过程中要戴手套;91mol/L Tris.HC1缓冲液Tris-HCl bufferpH
8.0将121g的Tris碱溶解于约
0.9L水中,再根据所要求的pH25℃下加入46ml的浓盐酸,用蒸储水调整终体积至1L;⑩6X凝胶加样缓冲液
0.25%浸酚蓝bromophenol blue取60nli双蒸水,将250mg浸酚蓝溶解于其中;40%W/V蔗糖水溶液sucrose inwater在上述溶液中加入40g蔗糖另外I.100mL5XTBE pH
8.0电泳缓冲液的配制:称取
5.4g Tris,
2.75g硼酸加入2mL
0.5mol/L EDTApH
8.0溶液中,再用蒸储水补加到100mLII.10ml组织匀浆液装入10ml离心管中的配制lOOmmol/L NaCl
0.2ml5M NaCl25mmol/L EDTApH
8.
00.5ml
0.5M EDTAH
8.0PlOmmol/LTris.HCIpH
8.
00.1ml IMLTris.HCIpH
8.0加三蒸水
9.2mlIII.1ml酶解液装入
1.5ml离心管中200mmol/L NaCl
0.04ml5M NaCl50mmol/L EDTApH
8.
00.1ml
0.5M EDTApH
8.020mmol/LTris.HC1pH
8.
00.02ml IMTris.HCIpH
8.01%SDS
0.5ml2%SDS200u g/mL蛋白酶K
0.02ml lOmg/mL加三蒸水
0.32mlW.提取液1平衡酚pH
8.0氯仿异戊醇25241即配即用,每管加500ul平衡酚pH
8.0250ul氯仿240ul异戊醇10ulV.提取液2氯仿异戊醇241即配即用,每支试管加500ul氯仿480ul异戊醇20ulVI.TE缓冲液5mllOmmol/L TrisJICKpH
8.
00.05ml IMLTris.HCIpH
8.0Immol/L EDTAPH
8.
00.01ml
0.5M EDTApH
8.0最后加三蒸水至
4.94mL
4.实验方法步骤及注意事项1)实验方法步骤第一步操作破碎、酶解细胞(过夜)⑴取
0.2g鼠肝,用冰冷的生理盐水洗3次,然后置于
2.0mL匀浆液中,用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作,切勿将细胞破碎,可镜检观察);
(2)将组织细胞液移至
1.5mL离心管中,5000r/min离心30—60s,(尽可能在低温下操作),弃上清,若沉淀中血细胞较多,可再加入5倍于细胞体积的匀浆液洗一次;⑶沉淀加400uL无菌水迅速吹散,再加400uL酶解液,翻转混匀(动作一定要轻)55c水浴处理12—18h;第二步操作抽提DNA、乙醇沉淀纯化DNA
(4)取20uL RNase加入L5ml离心管内,使RNase至终浓度200n g/mL,37c水浴lh;⑸将待抽提的样品等量分装在两支离心管内,各加入等体积
①提取液酚/氯仿/异戊醇500ul(25241现配先用),抽提(慢慢旋转混匀,倾斜使两相接触面增大)一次4℃10min静置,然后lOOOOr/min离心10min;
(6)用扩口吸头移出含DNA的水相.(注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有时如果DNA含量过高,水相在下层,实验时注意观察);⑺然后加等体积
②提取液:氯仿/异戊醇500ul(241现配现用)抽提,4℃静置10min,然后100001/01简离心1011皿(若界面或水相中蛋白含量多,可重复5,6,7操作);1⑻用扩口吸头小心吸出上层含DNA的水相,加1/10体积的NaAc,小心混匀(要充分);⑼再向每管中加入2倍体积的无水乙醇,-20℃l-2h;1012000r/min离心15min,弃上清;1175%冷乙醇洗涤一次,12000r/min离心15min;12室温干燥不要太干,否则DNA不易溶解,加入50ULTE缓冲液轻摇混匀,即可得到实验动物基因组DNA存放于4℃;第三步操作琼脂糖凝胶电泳检测DNAAgarose GelElectrophoresis13制备琼脂糖凝胶Preparation ofthe gel琼脂糖凝胶浓度为
0.3%;14加入DNA样品Loading DNAsamples DNAsamples16Ml+Loading buffer4Ml15电泳Gel电压120V16电泳结果的拍照Gel photography通过紫外透射仪检测凝胶,然后获取图片并将产物条带与已知分子量的标淮条带进行比较,便可以对合适分子量大小的产物进行鉴定2注意事项:1所有用品均需要高温高压,以灭活残余的DNA酶;2所有试剂均用高压灭菌双蒸水配制;3;用大口滴管或吸头操作,以尽量减少打断DNA的可能性;4用上述方法提取的DNA纯度可以满足一般实验如Southern杂交、PCR等目的,如要求更高,可参考有关资料进行DNA纯化;5进行小鼠基因组DNA样品室温干燥时,不要太过于干燥,否则DNA不易溶解;6在用冰冷的生理盐水洗鼠肝之前,先要将玻璃匀浆器置于冰块中,待温度下降到一定程度再将鼠肝放入玻璃匀浆器,冰浴操作,但切勿将细胞破碎,整个过程尽可能在低温下操作;7用无菌水迅速吹散沉淀,加入酶解液后,翻转混匀时动作一定要轻;8抽提时慢慢旋转混匀,倾斜使两相接触面增大,离心后用扩口吸头移出含DNA的水相时,注意勿吸出界面中蛋白沉淀,有时如果DNA含量过高,水相在下层,实验时注意观察二.实验内容
1.实验现象与结果此次试验本小组所得紫外透射仪检测凝胶照片显示的天道如图所示小白鼠基因组的电泳条带图DNA
2.对实验现象、实验结果的分析及其结论:1对实验现象的分析及其结论从上述所示的DNA电泳条带图可以看出小鼠基因组DNA的电泳条带都在同一条水平线上,但同时条带也有些暗淡,形状不佳2对实验结果的分析及其结论
①本次实验抽提所得到的小白鼠肝脏细胞基因组DNA样品不纯,可能含有其他的一些杂质;
②本次所用的凝胶浓度为
0.3%,浓度过低,也有可能是导致电泳条带形状不佳的原因之一
3.对本次实验的自我总结
①本次试验各个组员都积极参与,合作有序,按时按质完成了本次实验;
②通过本次实验进一步认识了作为分子生物学实验重要研究手段之----------琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术;
③由于本次哺乳动物组织基因组DNA提取实验未在电泳时向凝胶中加入相对分子质量标准物Marker作为标准对照,故不好进行进一步的分析教师评语及评分:签名:。