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文本内容:
实时定量PCR•实时定量PCR简介contents•实时定量PCR实验流程•实时定量PCR的仪器与试剂目录•实时定量PCR的优缺点•实时定量PCR的案例分析实时定量简介PCR01实时定量PCR的定义•实时定量PCR是一种在PCR反应过程中实时监测荧光信号强度的技术,通过荧光信号的变化来推算DNA的起始浓度,从而实现对DNA的定量分析实时定量PCR的原理在PCR反应过程中,随着DNA的扩增,荧光信号强度会随之增强通过监测荧光信号强度的变化,可以推算出DNA的起始浓度,从而实现定量的目的实时定量PCR采用荧光染料或荧光探针作为标记物,当DNA被扩增时,荧光物质被激发并发出荧光,荧光信号被检测器捕获并记录实时定量PCR的应用病原体检测实时定量PCR可以用于检测和定量病原体,如病毒、细菌和寄生虫等基因表达分析通过比较不同样本中同一基因的表达水平,可以研究基因的表达调控机制遗传疾病诊断通过检测特定基因的突变或表达异常,可以用于遗传疾病的诊断和产前诊断基因突变分析实时定量PCR结合特定探针可以用于检测基因突变,如点突变和插入/缺失突变等实时定量实验PCR02流程样本准备样本收集采集待检测样本,如细胞、组织或生物液体样本处理将样本进行破碎、匀浆或离心,以释放出核酸DNA/RNA提取使用试剂盒或离心柱法,从样本中提取出DNA或RNA引物设计与选择引物设计根据目标基因序列,设计特异性引物引物筛选评估引物的特异性、灵敏度和稳定性,确保引物适用于实时定量PCR反应体系配置配置缓冲液添加引物选择适当的缓冲液,以维持反应的稳定性和将设计的引物加入反应体系中特异性添加DNA/RNA模板添加荧光染料将提取的DNA或RNA模板加入反应体系中选择适当的荧光染料,以便在扩增过程中监测荧光信号实时定量PCR扩增预变性加热反应体系至95°C,使模板DNA完全变性1变性-退火-延伸按照设定的循环参数(如95°C变性、55°C退火、272°C延伸)进行扩增荧光信号监测在每个循环的延伸阶段,监测荧光信号,通过荧3光阈值判定是否达到阈值循环数(Ct值)结果分析数据处理将实验数据导入分析软件,计算目标基因的相对表达量结果解读根据相对表达量,分析目标基因的表达差异实时定量的仪PCR03器与试剂仪器介绍实时荧光定量PCR仪实时监测PCR反应过程中产生的荧光信号,通过荧光信号的强弱判断样品中目标基因的拷贝数仪器的性能参数包括检测通道数、检测范围、检测灵敏度、重复性等,这些参数直接影响实验结果的准确性和可靠性试剂介绍实时定量PCR试剂盒包含PCR反应所需的引物、探针、酶等成分,是进行实时定量PCR实验的必要试剂试剂盒的选择根据实验目的和检测样本的不同,选择适合的试剂盒,以确保实验结果的准确性和可靠性注意事项仪器的保养与维护定期对仪器进行保养和维护,以保证仪器的性能和延长使用寿命试剂的储存与使用实时定量PCR试剂盒需按照说明书要求进行储存和使用,以保证实验结果的准确性和可靠性实时定量的优PCR04缺点优点高灵敏度高特异性实时定量PCR能够检测到极低浓通过设计特异引物和探针,实时度的DNA,使其成为检测稀有基定量PCR能够精确地检测和定量因变异或低丰度表达基因的有力特定的DNA序列,避免非特异性工具扩增自动化动态范围广实时定量PCR可以在自动化平台实时定量PCR的动态范围可达到上进行,大大减少了手工操作,5-6个数量级,能够检测从单个分提高了实验的准确性和可重复性子到百万级别分子的DNA缺点成本较高需要标准品实时定量PCR需要使用专门的仪器和昂贵的为了准确进行定量,实时定量PCR需要使用荧光染料或探针,这使得该技术的成本相已知浓度的标准品,这增加了实验的复杂对较高性易受污染影响非线性扩增实时定量PCR对实验操作中的污染非常敏感,尽管实时定量PCR具有很高的灵敏度,但其如样品间的交叉污染或环境中DNA的污染,扩增反应并非完全线性,因此在某些情况可能导致实验结果不准确下,定量结果可能存在偏差实时定量的案PCR05例分析案例一基因表达分析总结词实时定量PCR在基因表达分析中发挥着重要作用,通过比较不同样本中特定基因的表达水平,可以研究基因的表达模式和调控机制详细描述实时定量PCR能够高灵敏度地检测低拷贝数的基因,通过设计特异引物和探针,对目的基因进行扩增和定量,从而精确地测量基因的表达水平这种方法广泛应用于基础研究和临床诊断领域,如肿瘤标志物检测、药物疗效评估等案例二突变检测总结词详细描述实时定量PCR是检测基因突变的有效手段,实时定量PCR结合高分辨率熔解曲线分析通过对突变位点的特异性扩增和检测,或等位基因特异性扩增等技术,能够检测可以快速准确地鉴定突变类型和频率VS出单个碱基的差异,从而对突变进行精确的定量和分型这种方法在遗传性疾病诊断、肿瘤基因突变筛查以及耐药性分析等方面具有广泛的应用价值案例三病原体检测总结词详细描述实时定量PCR在病原体检测中具有快速、灵实时定量PCR通过对病原体特异性基因的扩敏和高通量的特点,能够准确检测出极低浓增和检测,能够在短时间内实现病原体的快度的病原体,为感染性疾病的诊断和治疗提速鉴定和定量这种方法广泛应用于临床诊供有力支持断、食品安全和环境监测等领域,对于保障人类健康和公共安全具有重要意义THANKS.。