碱裂解法抽提质粒

碱裂解法抽提质粒中量质粒抽提原理质粒中量抽提的原理及各试剂组成均有质粒小量抽提一致，其主要区别在于中量质粒抽提所获得的质粒含量更高，同时，中抽试剂盒具有去类毒素的作用，其原因可能与吸附柱中含有类似氢氧化铝等对类毒素有吸附作用的物质有关类毒素是指由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素，但仍保留其抗原性医学微生物学中将类毒素定义为将细菌外毒素用甲醛处理脱去其毒性，保存其免疫原性即为类毒素仪器与试剂

0.3%~

0.4%﹑无水乙醇﹑漏斗﹑滤纸型高速离心机﹑型培养箱干燥箱﹑型立式恒温振荡器﹑3mnaac qiagenplasmidmidikitallegrax-12r beckman步骤ph030a/hz-2111ka（）将摇菌的菌液倒入无菌离心管中，，离心eppendorfbiophotometer，收集菌体沉淀；若不能及时抽质粒，可将离心管倒扣在吸水纸上，待残留1100mllb50ml10℃3700rmp培养基完全吸干时，菌体沉淀保存15min（）向菌体沉淀轻敲打散后，加入（已加入），振荡器上剧-20℃烈振荡，重新悬浮细胞；24mlp1buffer rnasea（）加入，轻柔颠倒次，静置时间不可超过，若细菌充分裂解，可看到溶液变为蓝色；34mlp2buffer4-65min（）加入，轻柔颠倒次，冰上静置（），离心（）吸附柱固定在锥形瓶上，平衡吸附柱（）44mlp3buffer4-615min;510℃3700rmp在吸附柱上放置一小漏斗，漏斗中放入滤纸，裂解上清经湿润的滤纸加入到吸附柱10min;6100ml4mlqbbuffer;7中；（）拿下漏斗，往吸附柱中加入，待过滤完后，再加入过滤；813mlqcbuffer（）吸附柱固定于无菌离心管上，洗涤并回收过滤液；（）7mlqcbuffer往回收液中加入预冷的无水乙醇和溶液，混匀，室温静置950ml5mlqfbuffer10以上，此步完成后可于保存；10ml250μl3mnaac1h（），离心，弃上清，扣干；4℃（）加入冰预冷的乙醇（先加入一定量的无水乙醇，再加入适量的水1110℃10000rmp25min使乙醇终浓度为），洗涤；（），离心，弃上122ml75%清；（）室温静置；75%dna1310℃10000rmp25min（）根据离心时管侧的量得多少，加入无菌水于离心管中，用145-10min移液枪轻轻吹洗，回收液体于管中；15dna250-500μl

1.5mlep（）取加入到无菌水中，混匀，测量浓度也可用琼脂糖凝胶电泳来检测浓度；164μldna196μl dna1%（）标记，保存；注意事项dna溶液的应储存于度；17-20℃作用时间不可过长，原因同质粒小抽；p14对沉淀进行洗涤时，必须先加入无水乙醇，再以水调至终浓度，否则，一旦p2溶于水中，则前功尽弃；dna实验过程中多次强调低温条件，为尽可能减少的损耗；细胞转染步骤（）转染前小时将细胞培养至细胞生长密度；（）转染前小时换dna完全培养基；（）配制转染试剂12460-80%22将无血清培养基、质粒、转染试剂依据不同细胞量按如下顺序加入3无需血清培养基质粒试剂试剂孔板dnaplus ltx孔板

120.1ml1μg1μl

2.5μl室温孵育

60.5ml2μg2μl5min室温孵育加入，，后在振荡器上轻微振荡混匀；5μl（）将上述配制好的试剂滴加至细胞培养上清，边加边来回晃动使转染试剂均匀30min dnaplus ltx分布；4（）于的培养箱培养小时，于荧光显微镜下观察，或者免疫印迹检测目的蛋白的表达情况；537℃co224-48细胞培养皿15μl10cm

1.2ml6μg6μl。