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实验室常见菌株保存方式菌株保存要求鼬作为一项重要的生物资源,对微生物学教学和研究是必不可少的菌种保存方法因微生物的不同而异在菌种保存过程中,必须使微生物的代谢处于最不活跃或相对静止的状态,才能在一定的时间内不发生变异而又保持生活能力低温、干燥和隔绝空气是使微生物代谢能力降低的重要因素,故菌种保存方法多依据这三个因素而设计菌种保存方法有多种,最理想的为真空冷冻干燥法,具有保存时间长、成活率高、变异小等优点,但操作技术难度大,花费高,需特殊设备,一般单位不易做到,而一些常规方法,常因传代次数多、易污染、易变异,给保存带来诸多不利多年来,微生物学工作者们一直在研究摸索简便而行之有效的菌种保存方法,笔者查阅相关资料并吸取同行工作者们的实践经验,总结了几种方法简便、效果好的保存方法,现介绍如下需要4T冰箱保存的保存法先将液体石蜡灭菌,然后放于37(恒温箱中,使水汽蒸发掉备用再将需要保存的菌种在最适宜的斜面培养基中培养用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡,注入已长好的斜面培养基上,用量以高出斜面顶端1cm为准试管需直立置4C或室温下保存,一般无芽胞细菌可保存1年左右
2、高层半固体琼脂石蜡保存法将需保存的菌种经平板划线分离后,挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中,经37℃12小时培养后取出,用无菌操作将灭菌的液体石蜡滴加半固体琼脂菌种管表层约
0.5cm高度存放4水箱,1年转种1次
3、蒸储水保存法取灭菌蒸储水6-7ml加于试管斜面上,用吸管研磨,洗下菌苔充分混匀将此菌液分装于灭菌的螺旋小瓶中或用胶塞密封,置4°C保存可存活数年需-20(:冰箱冷冻保存的保存法
1、甘油保存法甘油一生理盐水保存液的制备取甘油(分析纯)8份加入生理盐水2份,充分混合后,经1213℃30分钟灭菌备用将纯化后的菌株根据菌种不同分别划线接种于其最适宜生长的培养基上培养后,用接种针取典型菌落接种肉汤管37(培养6-8小时(链球菌和奈瑟氏菌接种血清肉汤管,5-10%CO2环境下8-10小时培养真菌直接用接种环取菌洗入肉汤管,不培养)此为培养液将此培养液与保存液以5:2的比例混合分装于灭菌的微量离心管,置-20℃冰箱保存(链球菌、奈瑟氏菌置-80(冰箱保存)使用时需37°C水浴中快速解冻用上述方法保存一般菌株可存活3年以上,链球菌、奈瑟菌可存活12・15个月,且性状未发生变异此方法采用幼龄肉汤培养物效果好,且适用于链球菌、奈瑟氏菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌种
2、低温保存法菌种保存液的配制K2HPO
412.6g柠檬酸钠
0.98gMgSO4-7H2O
0.18gKH2PO
43.6g甘油88g加蒸憎水至1000ml
103.4KPa灭菌30分钟,4(保存备用将细菌接种于肉汤培养基中,37℃培养16-18小时,或斜面培养物刮取于生理盐水中,然后加入等体积的菌种保存液,冻存于-70(或-2(TC冰箱中此方法也适合甲链、肺球、流感杆菌、百日咳杆菌、绿脓杆菌等耐受力低的细菌-7CTC保存10年以上,-2TC可保存2年以上
3、细菌湿种牛奶冻存法新鲜牛奶或15%奶粉煮沸,冷却脱脂,分装小试管,每管1ml8磅15分钟灭菌备用将纯种菌接种于平板37℃16小时培养,以接种环刮取菌苔2-3环于牛奶中混匀,试管用硅胶塞,冻存于普通冰箱冷冻室使用时取出室温溶解,待部分溶解时即可取一环接种平板,并将试管再迅速冻存,这样可反复使用3・5次此法一般菌株可存活48个月,少数如奈瑟氏菌、甲链、白喉等可存活14-30个月
4、甘油原液保存法将各待保存的菌种纯化后用接种环直接从平板上刮取,置于盛有
0.5ml甘油原液的菌种瓶中,-2CTC保存,可连续52个月存活良好此法尤其适合乙链、破伤风杆菌、产气荚膜梭菌、白色念珠菌等需特殊方法保存的菌种,是一种简便实用的有效保存方法需低温-30或-7rc冰箱保存
1、脱纤维羊血无菌抽取羊颈静脉血后,沿瓶壁注入无菌的带玻璃的三角烧瓶中,同时立即同一方向振摇约8-10分钟,脱去纤维,然后分装加盖无菌小试管中约
1.0-
1.5ml将脑膜炎双球菌、淋球菌、甲乙型链球菌、肺炎双球菌分别接种于血平板培养基中,前两者置于5-10%CO2烛缸内经35℃16-18小时培养后三者置37P恒温箱培养24小时然后无菌操作取一接种环菌苔移种于上述新鲜脱纤维羊血试管中,立即置-3水冻保存二年转种一次用时室温自然冰融即可接种
2、纸片法新华定性滤纸剪成4mmx4mm
1.5ml带盖离心管消毒灭菌备用用消毒小钳子钳上滤纸片于平板上刮取待保种的纯菌落2-3个放于离心管内塞盖再用封口胶布将盖边缘封好放于-3TC冰箱保存保存12个月后取出菌种解冻后用无菌钳取一片放于肉汤管内37培养12小时后转种血平板,性状未变异菌种保存液脱脂奶粉10gNaCL
10.5g,加双蒸水100ml121℃5分钟高压灭菌后分装于1ml带盖无菌标本杯中
0.5ml备用无菌操作用4mmx10mm无菌滤纸条蘸取新鲜菌少许,放存含奶粉液保存杯中盖好,封口胶封口,低温保存3年存活率达
99.2%使用时将标本杯取出,不等全部融化,上层有少许融化即用接种环取一少许接种于血平板分离即可结论菌种是细菌工作中所不可缺少而又具有传染性生物学因子为了保证工作和安全对菌种必须妥善保存和保管保存菌种不仅要求不死,还要求其生物学性状、生理特性、抗原性等方面不发生变异,这是保存菌种的重要环节延长菌种存活期应注意首先,待保存菌种须选择生长期幼龄培养物,且制成浓菌液保存,以保证存活率其次,高层半固体培基最好选择不含或含糖量低的培基,可减少或避免因代谢产物产生而造成的细菌死亡最后,保存温度的高低可影响存活率,切忌反复冻融以上介绍的几种方法,取材简单,操作容易已经反复实践证明保存时间长,变异小,适合中小型实验室使用。