制备PCR反应模板！

制备PCR反应模板!PCR反应的关键因素主要有引物的选择与设计，酶的质量.模板的制备，在前二者都稳定可行的情况下，PCR模板的制备尤为重要.模板处理方法的选择及操作人员的基本技能，决定分离模板核酸（DNA或RNA）的质和量及PCR的成败.而提高模板核酸质量的关键是除去杂质（蛋白质、酶、脂肪等）.除去抑制TaqDNA聚合酶活性抑制因子提高模板核酸的产量传统的核酸模板提取方法是采用去垢剂如SDS等来破坏细胞组份，溶解细胞膜，使蛋白质变性，再用蛋白酶K来消化去除蛋白质，尤其是与DNA结合的蛋白质，再用酚:氯仿抽提，然后用乙醇或异丙醇沉淀核酸，供PCR实验用.但近几年来也发展了些简便实用较为有效的标本消化处理方法.亦可满足PCR实验的要求.采用哪种方法消化处理标本，视PCR实验的目的（是科研还是检测）及环境条件而定模板核酸的提取制备方法

（一）蛋白酶K消化裂解法适用于所有标本的消化处理，尤以DNA样品为佳.如组织细胞（包括石蜡包埋组织）绒毛、毛发、精斑、血液（血清、血浆、全血）局部分泌物、尿，粪便等.

1.试剂配制

①蛋白酶K消化液配方:1Ommol/LTris.clPH

8.0配方后台留言联系

②蛋白酶K最好用水配成20mg/ml临用时加入消化液中.

2.提取方法有些标本、在用蛋白酶K消化前，还需预处理一下，如粪便、分泌物、痰液、组织块、石蜡包埋组织等，其方法有离心去掉杂质，脱蜡等.临床标本或经预处理的标本加蛋白酶K裂解液50~100ul.混匀55℃1~3小时，或37°C过夜.加等体积的饱和酚抽提1~2次，再加等体积的氯仿:异戊醇49:1抽提一次，上清加入1/10体积的pH值

5.23mmol/L醋酸钠缓冲液加入

2.5倍体积的冰冷无水乙醇或加等体积的异丙醇-2TC放置至少3h.取出后14000转/min离心15min.小心吸弃或倒出上清，沉淀加入75%冰冷乙醇15000r/min5min离心洗涤1~2次，特别小心的吸弃或倒掉上清，真空或37＜温箱或室温干燥，加TE缓冲液20ul.溶解后，取3〜8ul用于PCR扩增，或放-20保存.蛋白酶K消化法除上述经典处理法外，亦可在蛋白K消化处理标本，经离心处理后，吸取上清经95~97或煮沸10min灭活蛋白酶K后，直接作核酸模板用于PCR扩增.如杂质较多，还可经酚:氯仿抽提后，即可用于PCR反应.此法蛋白质及其它杂质消除彻底，Taq酶活性不受影响，具有良好的重复性与稳定性.但操作繁复，技术要求高.标本（组织细胞，分泌物）力口PBS或生理盐水离心洗涤后，加消化裂解液20~50ul（

0.5%NP-40和

0.5%吐温-20）95~98℃15-30min以裂解病原体裂解细胞.然后12000r/min离心5~10min，取上清20~30ul用于PCR扩增.血清标本可直加等体积的消化液，加热处理离心后PCR扩增.亦有用5%的NP-40和

1.5%2-ME做裂解液95℃30min消化处理，离心取上清，PCR扩增检测HBVDNA.

（三）碱变性法取血清20ul力口入1mol/LNaOH20ul37℃30min离心力口1mol/LHCI20ul离心后取上清5ul用于PCR扩增.*亦有用10ul血清加NaOH至

0.2mol/L37℃1h再加HCL中和离心后取上清10ul做PCR其特异性和敏感性较前法更好.

（四）煮沸法经离心洗涤过的组织细胞，分泌物及血液标本，加适量无菌蒸储水或PBS混匀后，100℃煮沸10~15min14000r/min10min取上清做PCR.

（五）碘化钠法取组织细胞及抗凝血液10〜100ul加等体积的6MNaI反复轻混20s加等体积氯仿:异戊醇（49:1）振匀后，离心取上清加

0.6体积的异丙醇，混匀后置室温3min.14000r/min10min沉淀加10~100ulTE溶解，取5〜10ul做PCR亦有用100ul血清加裂解液300ul（6MNai

0.5%十二烷基肌酸钠10ug糖原26mmol/LpH

8.0Tris-HCL13mmol/LEDTA）混匀后，60℃15min加等体积异丙醇，离心沉定后，加TE液用于PCR扩增，其产量和质量较高.

（六）异硫氟酸舰法此法主要用于RNA的提取.标本为组织细胞及血清等..异硫氨酸肌消化液配方配方后台留言联系.消化方法用50〜1003细胞悬液及血清，加等体积的异硫氨酸服消化液振混匀后，或65（1小时，或室温放置数分钟，然后加1/10体积的3mmol/LpH

5.2的醋酸钠缓冲液，再加等体积的酚:氯仿，用力振摇约10s10000r/min离心5min取上清加等体积异丙醇-2CTC放置3h后，14000r/min离心15min沉定用75%冰冷乙醇离心洗涤1~2次，真空干燥，沉淀用TE缓冲液溶解即可用于逆转录PCR扩增或放-2CTC保存.其它消化处理标本提模板核酸的方法有

①异硫氨酸胭一二氧化硅法

②异硫氟酸服-玻璃粉法.

③Chelex-100法.

④全血直接扩增法

⑤尿素消化裂解法.各有千秋，可根据情况选用.。