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LC-MS/MS定量分析的4个步骤嘉峪检测网2020-10-2709:
53.准备工作查阅文献做好样品前处理,萃取浓缩分离纯化有条件的可先在HPLC上摸好LC条件,能够基本分离更好,缓冲体系符合MS要求溶剂包括水的纯度,最好色谱纯以上新的色谱柱可能要先冲洗很长时间才能干净,某些样品非常容易吸附在进样阀和管路中,用溶剂清洗质谱仪须校准,预热时间要足够长,气流的稳定也很重要,液N气阀开度要注意,达到稳定程度.MS条件优化——先定性后定量•首先,确定离子化方式ESIorAPCIPOSorNEG•用10-100ppm的纯样,QISCAN察看存在哪些离子,要能够看到待测的母离子,应明显比周围的噪声离子高,通过改变DP观察离子的增减,若为POS方式,看M+lM+18M+23等等,初步判断分子离子,如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适,或选择的溶剂体系不合适•母离子选M+H或M-H最好,但有时只有M+NH4M+Na等,这样CAD能量可能需要高些,选择[M+H]+还是+NH4+Na等,要由化合物决定力哈离子若稳定,则可用,不稳定则可能需换流动相,但+H通常好些,所需碰撞能量低,灵敏度高;如含CI可选择2个母离子峰•SIM与MRM单级Q只能SIMMRM可看成2个SIM选择性更好•再根据上一步确定的母离子进行PRODUCTSCAN确保所有碎片离子都来自待测化合物,而不是溶液中的杂质,找出较强的碎片离子信息还可改变CE从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对为最后LC-MS/MS联用做准备•做PRODUCTSCAN时,注意小数点后的位数MRM输入要准,灵敏度才高•先多选几个离子对,待出现基质干扰时可换,最后根据法规要求确定离子对数目MRM方式优化仪器,通过优化仪器参数,使得母、子离子都达到一定强度水平,使MRM灵敏度最高可先让仪器自动优化参数,然后再手动细致优化,只检测一对离子时根据TIC的强度来确定仪器参数,一次优化多对离子时,要根据每对离子的XIC强度来分别确定仪器参数先用注射泵优化COMPOUND项下面的参数,如DP、CE及CAD等,再接通LC用FIA优化其他参数如温度,气流和IS电压及离子源位置,或接一个三通,样品仍由注射泵进入离子源,同时LC保持需要的流量.然后进行MRM测定CURTAINGAS在不降低灵敏度情况下尽量大些,雾化辅助加热气流不用太大,这样可以提高信噪比,保持信号稳定分辨率的选择当样品较纯,Q3可选LOW提高灵敏度,若选LOW后本底噪声太高则意义不大
3.LC条件优化•色谱柱长度可根据分离的要求而定,定性可长些定量在能有效排除干扰情况下尽量短提高效率;内径最好选细径柱如2mm的1mm的IS可不分流,
4.6mm柱用1ml流量时如不分流灵敏度还不是最佳,不如流量低时更好流速高,峰形好•不同牌号色谱柱,效果很可能不同PH的影响-正离子方式PH要低些负离子方式PH要高些,除对离子化有影响外,还影响LC的峰形,以至定量误差流动相加乙酸锭可适合大部分测定要求用流动相配的标样,初步优化确定LC条件是否合适标准品工作液现配现做,尤其是较低浓度,时间长了可能因吸附分解等降低进样顺序要先稀后浓洗针液要常换,进过浓样后要进一针空白,检验是否有残留污染•顺序纯样-添加样-实际样品流动相液优化后,空白提取液配制标准再优化,看干扰,空白添加再提取后看回收率用空白提取液配制标准样做曲线,准确,有效排除干扰因素前处理方法的优化LCMS都优化还不行,改提取方法离子抑制-改变前处理方法或LC条件内标用法,药代动力学时多采用内标,选择原则内标物与被测物的化学性质有区别时,要注意干扰基质对他们的离子化影响的不同,尽量选同系物还可利用同位素标记衍生化有时有助于信号强,且稳定,例如硝基味喃类,衍生化后容易测量
4.数据处理・最低检出限,信噪比~3:1定量限~10:1同一物质几对离子的比例应相对恒定,误差不超过15%峰面积比峰高准确当浓度低,信号弱,自动积分不准时可对峰面积手动积分平滑次数与峰宽因子、保留时间等设置都会影响积分值曲线过零点时,可用4个点;不用,则要5个点线性范围太宽,有时意义不大。