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ELISA中结合物的要求、制备、保存、稀释主要事项!结合物即酶标记的抗体(或抗原),是ELISA中最关键的试剂良好的结合物应该是既保有酶的催化活性,也保持了抗体(或抗原)的免疫活性结合物中酶与抗体(或抗原)之间有恰当的分子比例,在结合试剂中应尽量不含有或少含有游离的(未结合的)酶或游离的抗体(或抗原)此外,结合物尚要有良好的稳定性酶用于ELISA的酶应符合以下要求纯度高,催化反应的转化率高,专一性强,性质稳定,来源丰富,价格不贵制备成酶结合物后仍继续保留它的活性部分和催化能力最好在受检标本中不存在相同的酶另外,它的相应底物易于制备和保存,价格低廉,有色产物易于测定等在ELISA中常用的酶为辣根过氧化物酶(horseradishperoxidaseHRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosohataseAP)e在少数商品ELISA试剂中,应用的酶尚有葡萄糖氧化酶、3D-半乳糖甘酶和腺酶等国产ELISA试剂一般都用HRP制备结合物HRP是一种糖蛋白含糖量约为18%分子量为44000是一种复合酶,由主酶(酶蛋白)和辅基(亚铁血红素)结合而成,是一种口卜琳蛋白质主酶无色糖蛋白在275nm波长处有最高吸收峰,辅基是深棕色的含铁吓琳环,在403nm波长处有最高吸收峰HRP的纯度用RZ表示,是403nm的吸光度与280nm吸光度之比HRP除符合上述的ELISA中标记酶的要求外,更有价格低廉和性质较稳定的特点值得注意的是,在选用酶制剂时,除其纯度RZ外,更应注意酶的活力高纯度的酶如保存不当,活力也会降低酶制剂的活力以所含的酶活力单位表示可用对底物作用后生成产物量的测定进行试验国外很多ELISA试剂采用碱性磷酸酶AP作为标记酶常用的AP有两个来源,分别从大肠杆菌和小牛肠膜中提取不同来源的酶生化特性特性略不相同,从大肠杆菌中提取的AP分子量为80000,酶作用的最适合pH为
8.0;用小牛肠膜中提取的AP分子量为100000,最适pH为
9.6在ELISA中,AP系统的敏感度一般高于HRP系统,空白值也较低,但AP价格昂贵,制备结合物所得率也较HRP低抗原和抗体制备结合物时所用抗体一般均为纯度较高的IgG以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰最好用亲和层析纯的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性可以在高稀释度进行反应,实验结果本底浅淡如用Fab2进行标记,则更可避免标本中RF的干扰在ELISA中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗原必须是高纯度的需HRP标记保存液配方、PCR缓冲液配方、核酸样本提取液配方后台留言联系3结合物的制备酶标记抗体的制备方法主要有两种,即戊二醛交联法和过碘酸盐氧化法1戊二醛交联法:戊二醛是一种双功能团试剂,它可以使酶与蛋白质的氨基通过它而联结碱性磷酸一般用此法进行标记交联方法一步法、两步法两种在一步法中戊二醛直接加入酶与抗体的混合物中,反应后即得酶标记抗体ELISA中常用的酶一般都用此法交联它具有操作简便、有效结合率达60%-70%和重复性好等优点缺点是交联反应是随机的,酶与抗体交联时分子间的比例不严格结合物的大小也不均一,酶与酶,抗体与抗体之间也有可能交联,影响效果在两步法中,先将酶与戊二醛作用,透析除去多余的戊二醛后,再与抗体作用而形成酶标抗体也可先将抗体与戊二醛作用,再与酶联结两步法的产物中绝大部分的酶与蛋白质是以1:1的比例结合的,较一步法的酶结合物更有助于本底的改善以提高敏感度,但其偶联的有效率较一步法低2过碘酸盐氧化法本法只适用于含糖量较高的酶辣根过氧化物酶的标记常用此法反应时,过碘酸钠将HRP分子表面的多糖氧化为醛基很活泼,可与蛋白质上的氨基形成Schiff氏碱而结合酶标记物按克分子比例联结其最佳比例为酶/抗体=1-2/1此法简便有效,一般认为是HRP最可取的标记方法,但也有人认为所有试剂较为强烈,各批实验结果不易重演按以上方法制备的酶结合物一般都混有未结合物的酶和抗体理论上,结合物中混有的游离酶一般不影响ELISA中最后的酶活性测定因经过彻底洗涤,游离酶可被除去,并不影响最终的显色但游离的抗体则不同,它会与酶标抗体竞争相应的固相抗原,从而减少了结合到固相上的酶标抗体的量因此制备的酶结合物应予纯化,去除游离的酶和抗体后用于检测,效果更好纯化的方法很多,分离大分子化合物的方法均可应用硫酸镇盐析法最为简便,但效果并不理想,因为此法只能去除留在上清中的游离酶,但相当数量的游离抗体仍与酶结合物一起沉淀而不能分开用离子交换层析或分子筛分离更为可取,高效液相层析法可将制备的结合物清晰地分成三个部分游离酶、游离抗体和纯结合物而取得最佳的分离效果,但费用较贵结合物制得后,在用作ELISA试剂前尚需确定其适当的工作浓度使用过浓的结合物,既不经济,又可使本底增高;结合物的浓度过低,则又影响检测的敏感性所以必须对结合物的浓度予以选择最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时能维护一个低的本底,并获得测定的最佳灵敏度,达到最合适的测定条件和测定费用的节省就酶标抗体本身而言,它的有效工作浓度是指与其相应抗原包被的载体作试验时,能得到阳性反应的最高稀释度例如某一HRP:抗人IgG制剂标明的工作浓度为1:5000,表示该制剂经1:5000稀释后,在与人IgG包被的固相作ELISA试验时,将发生阳性反应但在用于具体的ELISA检测中,酶标抗体的最适工作浓度受到固相载体的性质、包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本、反应温度和时间等的影响,因此必须在实际测定条件下进行“滴配”选择能达到高敏感度的最大稀释度作为试剂盒中的工作浓度
4、结合物的保存酶标抗体中的酶和抗体均为生物活性物质,保存不当,极易失活高浓度的结合物较为稳定,冰冻干燥后可在普通冰箱中保存一年左右,但冻干过程中引起活力的减低,而且使用时需经复溶,颇为不便结合物溶液中加入等体积的甘油可在低温冰箱或普通冰箱的冰格中较长时间保存早期的ELISA试剂盒中的结合物一般均按以上两种形式供应配以稀释液(见
3.
2.5)临用时按标明的稀释度稀释成工作液现在较先进的ELISA试剂盒均已用合适的缓冲液配成工作液使用时不需再行稀释,在4-8(保存期可达6个月由于蛋白质浓度较低,结合物易失活,需加入蛋白保护剂另外再加入抗生素(例如庆大霉素)和防腐剂(HRP结合物加硫柳泵,AP结合物可加叠氮钠),以防止细菌生长
5、结合物的稀释液用于稀释高浓度的结合物以配成工作液为避免结合物在反应中直接吸附在固相载体上,在稀释缓冲液中常加入高浓度的无关蛋白质(例如1%牛血清白蛋白),通过竞争以抑制结合物的吸附一般还加入具有抑制蛋白质吸附于塑料表面的非离子型表面活性剂,如吐温
200.05%的浓度较为适宜在间接测定抗体时,血清标本需稀释后进行测定,也可应用这种稀释液。