小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化方法详细版

小鼠原代骨髓细胞提取及诱导骨髓来源的巨噬细胞分化实验前准备超净工作台、水平式低速离心机、10ml离心管、75cm2细胞培养皿、2mL注射器、无菌40um尼龙过滤器、细胞吸管、无菌眼科剪、无菌眼科银、75%酒精溶液、无菌PBS溶液、红细胞裂解液、DMEM细胞培养基、胎牛血清、M-CSF因子、细胞计数版、倒置显微镜等操作步骤1C57BL/6小鼠颈椎脱臼处死，用75%酒精溶液对其充分消毒，固定小鼠2无菌条件下分离并取下小鼠的股骨和胫骨，小心不要打破骨头然后放入事先含有75%酒精的75cm2的细胞培养皿中3移入生物安全柜中，进一步分离去除骨周围组织，然后将其移入含有1XPBS的另一细胞培养皿中清洗最后再将其转移另一75cm2细胞培养皿含有1%双抗的DMEM的细胞培养基中等待下一步处理4用眼科组织剪去除股骨和胫骨的骨两端，然后含有2nliDMEM细胞培养基的注射器从骨的一个断端冲洗骨髓细胞到10ml无菌离心管中，重复3次51500r/min离心8min弃上清液6加入5nli红细胞裂解液，吸管反复吹打，然后静置3mino71500r/min离心8min弃上清液8加入5mlDMEM细胞培养基重悬细胞，然后用40um尼龙过滤器过滤细胞91500r/min离心8min弃上清液，重复3次10a加入含有20%FBS/DMEM的细胞培养液重悬细胞，到该步骤提取完毕b加入含有20ng/ml的M-CSF的20%FBS/DMEM细胞培养液重悬细胞，诱导骨髓细胞分化为巨噬细胞细胞计数，调整细胞浓度至IXIO/mL接种75cm2细胞培养皿中11放于37℃、5%二氧化碳饱培养箱中培养，待后续实验研究。