还剩18页未读,继续阅读
本资源只提供10页预览,全部文档请下载后查看!喜欢就下载吧,查找使用更方便
文本内容:
核酸分子杂交技术由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性,它已成为分子生物学中最常用的基本技术,被广泛应用于基因克隆的筛选,酶切图谱的制作,基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等其基本原理是具有肯定同源性的原条核酸单链在肯定的条件下相宜的温室度及离子强度等可按碱基互补原成双链杂交的双方是待测核酸序列及探针probe,待测核酸序列可以是克隆的基因征段,也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段依据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苗酸探针、RNA探针等固相杂交固相杂交solid-phasehybridization是将变性的DNA固定于固体基质硝酸纤维素膜或尼龙滤膜上,再与探针进行杂交,故也称为膜上印迹杂交斑步杂交dothybridization是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过度的标记好的DNA或RNA探针进行杂交该法的特点是操作简洁,事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分别核酸样品可在同一张膜上同时进行多个样品的检测;依据斑点杂并的结果,可以推算出杂交阳性的拷贝数该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量,而且特异性较差,有肯定比例的假阳性印迹杂交blottinghybridization种方法最牢靠简便,各家报道的原位PCR技术中,在标本处理和种类上尚不同(细胞悬液、涂片、组织切片等),想检测的靶核酸也不同(病毒或体细胞的DNA或mRNA),扩增的方法上有不同(单引物、多引物),最终显示的方法也不同(直接法、间接法I这些还都有待在今后的工作中积累阅历,以求全都原位PCR应用的课题,目前正片于开头阶段还很局限,对人体B细胞淋巴瘤中Ig单拷贝基因重组的检查以及对人体外周血中单核细胞HLA-DQ不同亚型的测定,归纳起来,主要应用于两方面;
(1)检测外源怀基因片段集中在病毒感染的检查上,如HIV、HPV、HBV、CMV等;
(2)内源性基因片段,如人体的单基因病、重组基因、易位的染色体、Ig的mRNA片段、癌基因片段等基因转染技术将特定的遗传信息传递到真核细胞中,这种力量不但革新了生物学和医学中很多基本问题的讨论,也推动了诊断和治疗方面的分子技术进展,并使基因治疗成为可能目前基因转移技术已广泛用于基因的结构和功能分析、基因表达与调控、基因治疗与转基因动物等讨论本部分将介绍目前基因转移的主要方法;重点介绍基因转移的病毒方法的基因转染(transfection)技术基因运载系统将某一特定的靶基因传递到靶细胞需要应用某一基因运载系统,目前将这一系统概括为两大类非病毒辣方法和病毒方法.基因转移的非病毒方法直接注射法将含有DNA的溶液直接注射到肌肉,以引起邻近的细胞摄入DNA燕进行表达,在肌细胞中,基因表达可持续数月磷酸钙共沉淀法将氯化钙、DNA和磷酸盐缓冲液混合,形成磷酸钙微沉淀,附着于细胞膜并经过细胞内吞作用耐是入细胞质该方法的转化效率通常很低脂质体染法指质体能在体内或体夕M共应运载外源性遗传物质进入细胞的载体脂质体介导的基因转移的最大优势在于能在活体内应用受体介导的基因转移依靠受体介导的细胞内吞途径以转移外源基因受体介导的基因转移方法是在质粒DNA和某种特异的多肽(配体)之间形成复合体,而这种多肽能为细胞表面的肥体所识别如若将DNA在体内运送至肝内,可以选将DNA和能与肝细胞受体特异结合的去唾液酸糖蛋白质偶联,以便通过细胞内吞过程而被摄入,这种DNA大部分被肝脏所摄取应用该方法转移的外源基因在活体内的表达持续时间较短,在评估实际应用前影上还在一些问题显微注射法在显微镜下,将DNA经同细胞玻璃针地接注入细胞,该法适合于各种培育生长的细胞,但需要肯定的设施和操作用支巧电穿孔法采用脉冲场将DNA导入培育细胞微粒子轰击法(基因枪)近几年进展较快的转移方法使用高能微粒子轰击将DNA导入培胞或活的哺乳动物组织内亚微粒的铝和金能自发地吸附DNA,将这些微弹加强速到很的速度轰击细胞试验结果表明,用这种方法靶基因可在皮肤、肌肉、肝、胰、胃和乳腺等细胞中表达胚胎干细胞法胚胎干细胞是从受精卵开头分裂至4个国胞阶段未分化和具有多种潜能的生殖细胞,能在体外培育,可作为正面细胞,制备转基因动物,以讨论基因定向整合或基因剔险及基因及能精子载体法最近发觉用精子和NDA-剂孵育可捕获得DNA通过受精过程,将外源性基因导入受精卵,可捕获得物物,大大间化了转基因动物的制备过程.基因转移的病毒的方法病毒作为基因转移的是基因递送有有并工具,病毒载体的优点有1在转化的细胞中传播重组的DNA分子作为稳定的遗传成分;2在可能将有有制陷的或突变的基因置于病毒调整信号的掌握下以进行讨论;3能将克隆的基因作为病毒微染色体的一部分并能进分别;4转移效率较高其主要缺点是病毒载体对外源基因的最大容纳量只有2500bpo目前常用的病毒载体有下列几种逆转录病毒载体逆转录病毒辣为RNA病毒它们的基因组编码在一条单链RNA他妇上病毒进入细胞通过逆转录作用,病毒RNA即转变为双链DNA分子,DNA进入细胞核并整合在细胞染色体中,这种整合的病毒称为原病毒在原病毒的两端各有一长末端重复序列LTRLTR内侧还有为复制所必需的其他挨次,包括包装信号目前常用的逆转病毒载体有CMV和SVDNA病毒载体主要有腺病毒相关病毒载体,腺端正毒载体,疱疹病毒载体对DNA病毒载体的讨论是当前基因基因治疗讨论中的重点领域常用的基因转染技术将外源基因导入靶细胞需要肯定的载体和导入方法,基因转技术则是将纯化的含有靶基因的质粒DNA送入细胞内,并在细胞内表达转染方法有多种,依据不同的细胞,贴壁或悬浮细所可选用不同的方法,其目的是要达到设置转染效率,影响转染产率的因素有多种,包括转染方法、操作技术、质粒DNA的纯度、靶细胞的生长状态等,下面重点介绍向几种常用的转染技术靶细胞的预备被用于作靶基因转染的细胞,其生长状态如何,将直接打算了基因转染效率如为贴壁生长的细胞,一般要求在转染前一日,必需应用胰酶处理成单细胞悬液,重新接种于培育皿或瓶,细胞密度以铺满培育器皿的60%为宜,转染当日,在转染前4小时换一将近新奇培育液对于悬浮细胞也需在转染前4小时换一次新奇培育液靶基因质粒DNA的预备用于转染的质粒DNA必需无蛋白质,无RNA和其了化学物质的污染,OD260/280比值应在
1.8以上应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准,目前大多采纳进口的术提取纯化试剂盒详细的基因转染技术有鳞酸钙介导的转染法、DEAE葡聚糖介导转染法、脂质体介导转染法及电击基因转导尘等靶基因被导入细胞后,一般在转染后48小时,靶基因即在细胞内表达依据不同的试验目的,48小时后即可进行靶基因表达的检测等试验如若建立稳定的细胞系,则可对靶细胞进行筛选,依据不同基因载体中所含有的抗性标志选用相应的药物,最常用的直核表达基因载体的标志物有潮霉素hygromycin和新霉素neomycin\转基因动物的建立和应用转基因动物是以试验方法交源基因导入宿主受精卵或早期胚胎细胞染色体基因组内,使其稳定整合和遗传给后代动物它主要采纳显微注射法、逆转录病毒载体感染法、精子载体法、电转移法与胚胎干细胞法转基因动物模型的建立,推动了肿瘤在分子水平上的讨论,它使人们熟悉到激活的原癌基因的特别表达及功能失常,是肿瘤发生的初阶段将癌基因与特定细胞的调控序列连在一起,可使癌基因在特定细胞中表达,讨论靶细胞对不同癌基因的易感性,阐明某一癌基因对特定细胞生长、分化及功能的影响;它还可以讨论多种基因的协同作用,有助于对多步骤致癌机进行深和的研讨转基因小鼠不但用以讨论癌基因的功能,还可以通过使某一基因功能丢失如用基因剔除技术讨论抑癌基因在肿瘤发一中的作用此外,转基因小鼠对致癌原的测试,为肿瘤的预防,治疗及发觉新的致癌物质都供应了有价值讨论工具基因突变的检测方法基因突变的研已成为当今生命科学讨论的热点之一,检测方法也随之快速进展人类细胞癌基因的突变类型已如上所述,对于基因突变的检测,1985以前采用Southern印迹法,可以筛选出基因的缺失、插入和移码重组等突变形式对于用该法法不能检测的突变只能应用简单费时的DNA序列测定分析法多聚酶链反应polymerasechainreactionPCR技术是突变讨论中的最重大进展,使基因突变检测技术有了长足的进展,目前几乎全部的基因突变检测的分子诊断技术都是建立于PCR的基础之上,并且由PCR衍生出的新方法不断消失,目前已达二十余种,自动化程度也愈来愈高,分析时间大大缩短,分析结果的精确性也有很大很提高其中包括单链构象多态性single-strandcomformationalpolymorphismSSCP和异源双链分析法heteroduplexanalysisHA\下面分别介绍几种PCR衍生技术及经典突变检测方法,可依据检测目的和试验室条件选择时参考PCR-SSCP法PCR-SSCP法是在非这性聚丙熔酰胺凝胶上,短的单链DNA和RNA分子依其大街基序列不同而形成不同构象,一个碱基的转变将影响其构象而导致其在凝胶上的移动速度转变其基本原理为单链DNA在中性条件下会形成二级结构,这种二级结构依靠于其碱基组成,即使一个碱基的不同,也会形成不同的二级结构而出刺同的迁移率由于该法简洁快速,因而被广泛用于未知基因突变的检测用PCR-SSCP法检测小于200bp的PCR产物时,突变检出率可达70%-95%片段大于400bp时检出率仅为50%左右该法可能会存在1%的假阳性率应用PCR-SSCP法应留意电泳的最佳条件,一般突变类型对检测的灵敏度无大的影响,同时该法不能测定突变的精确位点,还需通过序列分析来确定Sarkar等认为对于大于200bp的片段,用其RNA分子来做SSCP会提高其录敏度应用PCR-SSCP检测点突变已见报道于人类大部分的肿瘤组织或细胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等检测的基因包括多种癌基因及抑癌基因,也是检测抑癌基因p53突变最常用的方法仅检测第5-8外显子即可发觉85%以上的p53基因突变由于该法简便快速,特殊适合大样本基因突变讨论的筛选工作异源双链分析法HAHA法直接在变性凝胶上分别杂交的突变型一野生型DNA双链由于突变和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成一突起在非变性凝胶中电泳时会产生与相应的同源双DNA不同的迁移率该法与SSCP相像,所不同的是SSCP分别的是单链DNAHA法分别的是双链DNA也只适合于小片段的分析但HA对一些不能用SSCP检出的突变有互补作用,两者结合使用可使突变检出率提高至!]近100%.突变体富集PCR}gmutant-enrichedPCR本法的基本原理是采用ras基因家族某个密码子部位存在已知的限制性内切酶位点,如K-ras基因第12密码子的BstNI位点第13密古巴子有BglU位点用链续二次的巢式PCR来扩增包括K-ras第
12、13密码子的DNA片段,在两次扩增反应之间用相应的内切酶消化扩增的DNA片段,野生型因被酶切而不能进入其次次PCR扩增,而突变型则能完整进入其次次PCR扩增并得到产物的富集变性梯度凝胶电泳法denaturinggradinentelectrophoresisDGGEDGGE法分析PCR产物,假如突变发生在最先解链的DNA区域检出率可达100%,检测片段可达lkb最适围为100bp-500bpe基本原理基于当双链DNA在变性梯度凝胶中进行到与DNA变性湿度全都的凝胶位置时,DNA发生部分解链电泳适移率下降当解链的DNA链中有一个碱基转变时,会在不同的时间发生解链,因影响电泳速度变化的程而被分别由于本法是采用温度和梯度凝胶迁移率来检测,需要一套专用的电泳装置合成的PCR引物最好在5末端加一段40bp-50bp的GC夹,以利于检测发生于高熔点区的突变在DGGE的基础上,又进展了用湿度梯度代替化学变性剂的TGGE法温度梯度凝胶电泳temperaturegradientgelelectrophoresisTGGE\DGGE和TGGE均有商品化的电泳装置,该法一经建立,操作也较简便,适合于大样本的检测筛选化学切割错配法chemicalcleavageofmismatchCCMCCM为在Maxam-Gilbert测序法的基础上进展的一项检测突变的技术,其检测突变的精确性可与DNA测序相仿其基本原理为将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或DNA和RNA片段混俣变性杂交,在异源杂合的双链核酸分子中,错配的C能被羟胺或哌咤切割,错配的T能被四氧化饿切割,经变性凝胶电泳即可确定是否存在突变该法检出率很高,也是检片段最长的方法已有报功检测了
1.7kb片段,假犹如时对正、反义链进行分析,检出率可达100%应用荧光检测系统可增加敏感度,可检测到10个细胞中的1个突变细胞该法中的化学试剂有毒,又进展了碳二亚胺检测法catodiimideCDICDI为无毒物质,也可检测大片段DNA的点突变等位基因特异性寡核甘酸分析法allele-specificoligonucleotideASOASO为一种以杂交为基础对已知突变的检测技术以PCR和ASO相结合,设计一段20bp左右的寡核苗酸片段,其中包含了发生突变的部位,以此为探针,与固定在膜上的经PCR拉增的样品DNA杂交可以用各种突变类型的寡核甘酸探针,同时以野生型探针为对比,如消失阳性杂交带,则表水道样品中存在与该ASO探针相应的点突变,ASO需严格掌握杂交条件和设置标准对比避开假阳性和假阴性目前已有商品化的检测盒检测部分癌基因ASODNA芯片技术DNAchipDNA芯片技术是90年月后进展的一项DNA分析新技术,它集合了集成电路计算机、激光共聚焦扫描、荧光标记探针和DNA合成等先进技术可用于基因定位、DNA测序、物理图谱和遗传图谱的构建等在基因突变检测方面DNA芯片也有宽阔的前景,其基本原理为将很多已知序列的寡核昔酸DNA排列在1块集成电路板上,彼此之间重叠1个碱基,并掩盖全部所需检测的基因将荧光标记的正常DNA和突变DNA发别与2块DNA芯片杂交,由于至少存在1个碱基的差异,正常和突变的DNA将会得到不同的杂交图谱,经过共聚集显微镜分别检测两种DNA分子产生的荧光信号,即可确定是否存在突变,该方法快速简洁、片动化程度高,具有很大的进展潜力,将在基因突变检测中心发挥特别重要的作用连接酶链反应ligasechainreactionLCR与其他核酸扩增技术比较,其最大特点为可精确区分基因序列中单个基因突变,由Landegree于1988年首次应用于镰刀奖细胞贫血的分子诊断LCR是以DNA连接酶将某一DNA链的5-磷酸与另一相邻链3-羟基连接为基础,应用两对互补的引物,双链DNA经加热变性后,两对引物分别与模板复性,若完全互补,则在连接酶的作用下,使相邻两引物的5-磷酸与3-羟基形成磷酸二酯二酯键而连接,前一次的连接产物又作为下一次循环反应的模板,假如配对的碱基存在突变则不能连接和扩增LCR产物检测最初是通过这32p标记上游引物3未端,经变性凝胶电泳分别后放射自显影加以鉴定,其检测敏感性达到200个靶分子也可设计1个横跨两引物的检测探针,用它与LCR产物进行杂交检测近年有应用荧光素、地高辛等非核素标记方法Batt在1994年进展了一种更为简的方法,好微孑版夹心杂交法由于LCR的快速、特蛋和敏感的特性,以及能检测单个碱基突变的力量,因此被应用于肿瘤基因突变的分子诊断并与PCR结合用以提高其敏感性等位基因特异性扩增法Allele-specificamplificationASAASA于1989年建立,是PCR技术应用的进展也称扩增阻碍突变系统amplificationrefractorymutationsystemARMS\等位基因特性PCRallele-specificPCRASPCR等,用于对已知突变基因进行检测该法通过设计两个5端引物,一个与正常DNA互补,一个与突变DNA互补,对于纯合性突变,分别加入这两种引物及
3、端引物进行两个平行PCR吸有与突变DNA完互补的引物才可延长并得到PCR扩增产物假如错配位于引物的3端则导致PCR不能延长,则称为ARMSARMS和ASPCR借鉴多重PCR原理,可在同一系统中同时检测两种或多种等位基因突变位点ASA法的检出率依靠于反应条件的优化和可能发生的引物与靶DNA有氏配时错配延长,特殊是当错配碱基为G:T时,这时可通过调整试验条件如弓件勿靶DNATaqDNA聚合酶的浓度等来得高瓜在特异性在反应体系中加入甲酰胺也可削减非特异性扩增还可通过在引物3端的其次个碱基引入一个错配碱基,使之与模板之间形成双重错配以阻挡错误延长RNA酶A切割法RNaseAcleavage在肯定条件下氨基源双链核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中的错配碱基可被RNaseA切割切割产物可通过变性凝胶电泳分别当RNA探针上错配的碱基为口票吟时,RNaseA在错配处的切割效率很低,甚至不切割,而当错配碱基为口密嚏时,则其切割效率较高故假如仅分析被检DNA的一个条链,突变检出率只有30%犹如时分析正义和反义二条链,检出率可达70%该法需要制备RNA探针,增加了操作的简单性,但可用于l-2kb的大片段进行检测,并能确定突变位点于这些优越性,它仍被作为一种经典方法用于对未知突变进行分析染色体原位杂交Insituhybridizationofchromosome染色体发觉距今已有150多年的历史,染色体检测被广泛用于动、植物及人类的细胞遗传学讨论,随着染色体分技术和分子生物学技术的进展染色体讨论范围也不断扩大,特殊是用于肿瘤分子诊断肿瘤细胞的染色体变化是一特别普遍的现象,可分为原发和继发两类在肿瘤形成的生物学基础方面原发性的染色体变化与引起肿瘤的直接缘由有关,肿瘤细胞中可以发觉各种形式的染色体畸变,如缺失、重复、易位、重排、单体断裂及核内复制等;继发性变化主要是肿瘤细胞核型的转变染色体的检测对于肿瘤的诊断、鉴别诊断、生物学行为判别等方面都重要意义染色体的检测方法进展很快,检测的精确率也不断提高,这里主要介绍荧光原位杂交和PRINS法荧光原位杂交技术fluorescentinsituhybridiaationFISH仓]建于1986年1969年Gall和Pardue首先应用核素标记核甘酸制备探针,通过放射自显影检测杂交信号应用核素标记的探针其敏感性可以检测到中期染色体上几百碱基的单拷贝靶核昔酸序列,敏感性虽高,但定位不够精确FISH具有探针稳定、操作平安,可快速、多色显示多个不同探针的杂交信号等优点FISH的灵敏感与探针标记方法和检测仪器性能有关,探针标记时掺入的修饰核甘酸比例直接影响杂交信号强度FISH探针一般采纳随机引物法或切口翻译法,如将PCR技术引入FISH探针标记,可使其灵敏度提高到
0.25kb应用慢扫描CCD协作影像处理理软件,增加信噪比,有利于检测微弱信号,如应用TSA系统tyramidesignalamplification能将杂交信号再放大1000倍可用于单拷贝基因的定位FISH辨别率大约为1-3Mb假如应用强变性剂处理染色体,让Southern印迹杂交凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段,将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上,经干烤固定,再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应,用放射性自显影或酶反应显色,检测特定大小分子的含量可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析(RELP)等Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演化而来,其被测样品是RNA经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分别后,转移到固相支持物上,进行杂交反应以鉴定基中特定mRNA分子的量与大小该法是讨论基因表达常用的方法,可推臬出癌基因的表达程度差异杂交(differentialhybridization)是将基因组文库的重组噬菌体DNA转移至硝酸纤维素膜上用两种混合的不同cDNA探针(如转移性和非转移性癌组织的mRNA逆转录后的cDNA)分别与滤膜上的DNA杂交,分析两张滤膜上对应位置杂交信息以分别差异表达的基因适用于基因组不太简单的真核生物(如酵母)表达基因的比较,假阳性率较低但对基因组特别简单的盐酸核生物(如人),则因工作量太大,表达的序列所占百分比较低(仅5%左右),价值不大cDNA微点隈杂交(cDNAmicroarrayhybridization)是指将cDNA克隆或cDNA的PCR产物以高度的列阵形式排布并结合于固相支持物上(如尼龙膜或活化的载玻片)以微点阵,然后用混合的不同DNA探针与微点阵上的DNA进行杂交再采用荧光、化学发光、共聚焦显微镜等技术扫描微点阵上的杂交信息它比差异杂交技术的效率高、速度快、成本低,适用于大规模的分析已成商品问世其缺点是无法克服保守的同源序列及重序对杂交信息的干扰DNA分子从蛋白质中分别出来,使双DNA完全伸展并粘附在玻片上,经引处理后,辨别率可达l-2kbo还可采纳对分裂中期染色体进行显微解剖microdissect法以提高辨别率FISH的另一个特点是可以联合庆用地高辛、生物素等多种标记系统,在一次杂交中可检测多种探针在染色体上的位置及探针间的相互关系,即多色FISH或多靶FISHFISH技术已被广泛应用于肿瘤讨论中的基因扩增、易位重排及缺失等的检测,在肿瘤诊断和鉴别诊断、预后和治疗监控等方面都有重要意义Klch等于1989年创造了染色体上寡核昔酸引物原位DNA合成技术oligonucleotideprimedinsituDNAsynthesisPRINS,并胜利地用于染色体特异a卫星DNA标记其基本原理是用非标记的寡核甘酸引物同染色体上靶序列特异性地杂交在DNA聚合酶作用下,当引物延长时,掺入标记的核革酸可直接或间接地检量标记位点PRINS技术的优点是不需克隆基因作探针,且由于杂交反应在前,标记在后,故非特异怀背景低缺点是信号弱,灵敏度低,为克服这一制眯,Terkelsen等建立了重复引物原位标记技术repeatedPRINS,重复进行PRINS反应,使信号号强度明显提高基于FISH的原理,进展了多色原位经物标记multicolorPRINS,可测定二个以上靶序列在DNA分子上的相互的位置,且特异性比FISH还高DNA序列分析DNAsequencing应用各种突变检测技术检测到的基因突变最终都需用序列分析才能确定突变类型及突变位置,其效率可以达到100%现在的测序方法已与经典的方法有了很大的不同,其基本原理虽仍是双脱氧终止法,但自动化程度大为提高操作更简便测序时间也大大缩短随着PCR技术与测序联合使用,不需经过M13亚克隆步骤故称为直接测序法directsequencingDS\DS法测序的模板主主要来源于PCR应用不对称PCRasymmetricPCR和基因组扩增转录同步测序法genomicamplificationwithtranscriptsequencingGAWTS等,使单链产物大大增力口近年来PCR循环测序法的建立,使模板扩增与同步进行,引物用四种不同前颜色的荧光标记,使每个样品的四个测序反应可在一个反应管和一个泳道内进行,大大提高了测邓的自动化程度目前PE公司推同出的DNA自动测序仪已进展到96泳道,并仍在不断改进这些高度自动化的测序方法是经较抱负的基因突变分析技术,但其昂贵的费用其使用范围,所以对一些小样本或为了某些特定目的的样本分析,仍进行经典的手工测序突变基因的检测方法多种多样特殊是PCR技术诞生后,很多检测技术都是在PCR基础上衍生的由于PCR扩增南非要的模板量少,使对肿瘤的突变分析可以精确到单细胞,如霍奇金病的R-S细胞的单细胞基因突变分析此外,应用显微解剖法microdissection可在组织切片上较精确地选择需检测的靶点,其优点是可克服肿瘤组只中间质或癌周组织的混杂,提高精确性除上述介绍的方法外,还有多种方法也用于基因突变的分子检测,如对未知突变基因进行分析的酶促切害错酉己法enzymemismatccleavagezEMC\切割片段长度多态性cleavagefragmentlengthpolymorphism^EFLP\双脱氧指纹图谱法dideoxyfingerprintingddF错配接合蛋白质截短测试法proteintruncationtestPTT等对已知突变基因进行分析的有引物延长法primerextensionPEX\寡核苗酸链接检测法oligonucleotideligationassayOLA、毛细管电泳法capillaryelectrophoresisCE等方法寡核吉酸微点隈杂交oligonucleotidemicroarrayhybridization是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苜酸,使它共价结合于支持物表面与平均长度为20-50nt的混合RNA或cDNA探针进行杂交,以提高杂交的特异性和灵敏度应用共聚焦显微镜可检测跨越三个数量级的杂交信息适用于低丰度mRNA的检测,以区分基因家族不同成员的差异表达特征,或鉴定同一转录在不同组织和细胞中的选择性剪接但有工作量较大、成本较高、速度较慢等弱点液相杂交solutionhbridization指使变性的待测核酸单链与放射笥核素标记的已知的酸单链探针在溶液中保温,使之形成杂交复合物反应结束后,用羟磷灰石法或酶解法将未被杂交的单链和杂交双链分开,然后结膈后在杂妆分子中的探针量,就可推算出被测的核酸量递减杂交subtractivehybridizatio是采用两种来源全都而功能不同的组织细胞提取mRNA或逆转录成的cDNA,在肯定的条件下以过度的驱动mRNA或cDNA与测试的单链cDNA或mRNA进行液相杂交,通过羟基磷灰石柱层析筛选除去两者间同源的杂交体经多轮杂交策选、除去两者之间相同的基因成分,保留特异表达的目的基因或工基因片段以后者筛选cDNA文库,可获得特异表达的目的基因cDNA全长序列核酸原位杂交用特定标记的已知挨次核酸作为探针与细胞级或组织切片中核酸进行复性杂交并对其实行检测的方法,称为核酸原位杂交(nucleicacidhybridizationinsitu\用来检测DNA在细胞核或染色休上的分布,与细胞内RNA进行杂交以讨论该组织细胞中特定基因表达水闰;还用于细胞、组织中有无特异性菌、病毒检测的讨论该法的优点是特异性高,可精确定位;能在成分简单的组织中进行单一细胞的讨论而不受同一组织中其他成分的影响;不需要从组织中提取核酸对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性;并可完整地保持组织与细胞的形态因此被广泛应用于医同学物学的讨论,如基因定位、基因制失,基因易位、特异基因整合部物色检测等讨论近年来由定性进展到定量,方法更为完善DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)其基本步骤包括制备目的基因一将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接制成DNA重组一导入宿主细胞一筛选、鉴定一扩增和表达载侬vecors)在细胞内自我复制,并带动重组的分子片段共同增殖,从而产生大量的DNA分子片段主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝,有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆就可以深化分析基因的结构与功能,随着引入的DNA片段不同,有两种DNA库,一种是基因组文库(genomiclibrary),另一种是cDNA库载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA,分子大小为l-20kb,对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有肯定的作用质粒载体是在自然质粒的基础上人工改造拼接而成最常用的质粒是PBR322噬菌体phaeg噬菌体是感染细菌的病毒,按其生活周期分为溶菌型及溶原型两型用野生型入噬菌体改造和构建的噬菌体载体是线性双链DNA基因组约为50kb最常用的哓菌体为入DNA及其衍生系列黏性质粒cosmid是由质粒与噬菌体XDNA组成的一种4-6kb的环状杂种DNA表达型载体将上述细菌质粒载体或噬菌体载体接上启动基因及多聚核糖体的基因序列组成了表达型载体基因库的建筑含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体,其含有感光趣的基因片段的重组子,可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来,所得到的克隆经过纯化和扩增,可用于进一步的研其主步骤包括1构建基因库快速的载体;2DNA片段的制备;3DNA片段与载体DNA的连接;4包装和接种cDNA库的建筑是指克隆的DNA片段,是由逆转录酶自mRNA制备的cDNAocDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库不含内含子特异基因的筛选常用的方法有1克隆筛选即探针筛选法;2抗体检测法,检测其分泌蛋白质来筛选目的基因;3放射免疫筛选法,查出分泌特异抗原的基因;4免疫沉淀法,进行特异基因的筛选核酸序列测定DNA的碱基序列打算着基因的特性DNA序列分析(测序sequencing)是分子生物学重要的基本技术无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因,最终均需进行核酸序列分析,可藉以了解基因的精细结构,获得其限制性内切酶图谱分析基因的突变及对功能的影响,关心人工俣成基因、设计引物,以及讨论肿瘤的分子发病机制等测序是在高辨别率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等,近年来已有DNA序列自动测定仪问世化学降解法是在DNA的片段的5端标记核素然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解在电泳和自显影后可得到从标记端延长的片段供测读序列和进行比较-般能读出200-250个核苜酸序列双脱氧法是采纳核甘酸链终止剂,如23-双脱氧核首三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入至(JDNA链中以终止链的延长,与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应,这样可得到一组结尾长衙不
一、不同专一性核甘酸链终止剂结尾的DNA片段,经凝胶电泳分别和放射自显影,可读出合成的DNA核苗酸序列,依据碱基互补原则,可推算出模板DNA分子的序列化学降解法只需一化学试剂,重复性好,简洁把握;而双脱氧法需单链模板、特异的寡核苗酸引物及高质量的DNA聚合酶,便随着M13噬菌体载体的创造和运用合成的引物简洁获得测序技术不断改进,故此法已被广泛应用基脱氧法的自动激光荧光测序仪使测工作更快速和简便而且保证高度重复性至于RNA测序现大多采纳将mRNA逆转录成cDNA后同测序,然后反推RNA序列聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术简称PCR技术,是一种采用DNA变性和复性原理在体外进行特定的DNA片断高效扩增的技术,可检出微量靶序列甚至少到1个拷贝I在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核昔酸存在的条件下依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应仅需用极少量模板,在一对引物介导下,在数小时内可扩增至100万-200万份拷贝PCR反应分三步变性、退火及延长以上三步为一循环,每一循环的产物作为下一个的模板这样经过九小时的循环,每一循环的产物作为下一个循环的模板,这样经过数上时的循环后,可得到大量复制的特异性DNA片段反应条件一般为94变性30秒,55工退火30秒70-722延长30-60秒,共进行30次循环左右,最终再延长72℃5分钟,4令却终止反应.逆转录PCRRT-PCR用来扩增RNA的方法.竞争逆转录PCRcompetitivereversetranscription-polymerasechainrectionC-RT-PCR低丰度RNA定量的好方法多重PCRmultiplesPCR在同一PCR体系中加入多对引物可用于基天长度很长发生多处缺失的检测扩增同一模板的几个区域.多种PCR可同时加入多套以生物素标记的引物起进手PCR反应.反向PCRiversepolymerasechainreaction对一个已知的DNA片段两侧的未知序列进行扩增和讨论.不对称PCR在扩增循环中引入不同引物浓度,以得到单链DNA并进行列测定以了解目的基因的序列.锚定PCRanchoredpolymerasechainreaction关心克月员序歹J未知或序歹!]未全知带来的障碍在未知序列未端添加同聚物尾序,将互补的引物连接于一段带限制性内切酶位点的锚上,在锚引物和基因另一侧特异性引物的作用下,将未知序列扩增出来.着色互补碘佥或荧光PCRcolorcomplementationassayorfluorescentPCR原理是用不同荧光染粒,分别标记于不同寡核甘酸引物上同时扩增多个DNA片段反应完毕后,采用分子筛选去多余的引物用紫外线照耀扩增产物,就能显示某一DNA区带荧光染料颜色的组合,假如某一DNA区带荧光染色料颜色的组合,假如某一DNA区带缺失,则会缺乏相应的颜色.双温PCRtwo-temperaturePCR仅仅执行两步温度程序合并退火与延长温度一般常用温度是94-95P和46-47℃o可以提高反应的速度和特异性上述这些PCR技术的应用:1PCR技术扩增特定序列为基础,采纳多种方法进行检测,如PCR-RFLP.PCR-SSCP从已克隆的双链DNA中产生特异性序列作为分子探针;2通过选择性扩增cDNA中产生特异性序列作为分子探针;2通过选择性扩增cDNA中的特殊片段,产生针对尚未克隆的基因的探针;3从微量mRNA中产生cDNA文库;4产生大量用于序列分析的DNA;5分析基因突变;6做染色体步移.原位PCR技术PCR虽然能扩增包括福尔马林固定、石蜡包埋组织的各种标本的DNA,但扩增的DNA或RNA产物不能在组织细胞中定位,因而不能直接与特定的组织细胞特征相联系,这是该技术一个局限性原位杂交虽具有良好的定位力量,但由于其敏感性问题,尤其是在石蜡切片中,尚不能检测出低含量的DNA或RNA序列而原位PCRInsituPCR简称ISPCR,它可使扩增的特定DNA片段在分别细胞和组织切片中定位从而弥补了PCR和原位杂交的不足,具有良好的应用前景目前,已有多种设计的原位PCR扩增仪系统问世,使操作简便,软件敏捷,已成为拉增固定细胞和石蜡包埋组织中特定DNA和RNA序列的有用工具ISPCR的技术特点
(1)既具有PCR的特异性与高灵敏性,又具有原位杂交的定位精确性;
(2)测到低于2个拷贝量的细胞内特定DNA序列,甚至可检测出单一细胞中的仅含一个拷贝的原病毒DNA;
(3)有助于细胞内特定核酸序列定位与其形态学变化的结合分析;
(4)可用于正常或恶性细胞,感染或非感染细胞的鉴定与区分ISPCR的基本方法IS-PCR是PCR和原位杂交两种技术的绫事,实质是一种将靶DNA或RNA在原位扩增后再进行原位杂交的技术,操作程序基本兼有两种技术的全部过程,首先在适当处理的细胞和组织切片上滴加PCR反应液,然后把载玻片放入热循环仪中进行扩增,最终通过标记的探针进行原位杂交检测扩增产物初步应用有关原位PCR技术应用胜利的第一篇报道是对感染绵羊中枢神经系统visna病毒在绵羊脉络从一细胞中检查,通过PCR扩增仅用150碱基对的短探针就可通过ISH检查到了细胞内的visna病毒从开头在试管内细胞行PCR扩增后再涂片做ISH(原位杂交)检查已进展到用福尔马林固定、石蜡切片的常规病理组织方法做原位PCR检查有传统的标记探针的原位PCR法(间接法)也有将标记物先标记PCR的引物,让标记物扩增后再行ISH检查的直接法因此,目前就原位PCR方法而言,尚未能获得统一,也即未能比较出哪一。