细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书中文版主要用途

细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂盒产品说明书中文版主要用途细胞内氧化应激活性氧单线态氧气比色法定量检测试剂是一种旨在通过二甲基4亚硝基苯胺，受到单线态氧气-的作用，出现去色现象，由分光光度仪比色分析，定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的生成和增加的权威而经典的技术方法该技术经过精心研制、成功实验证明的可以被用于细胞凋亡、信号传递、衰老、代谢和营养学等的研究其适用于各种活体细胞动物、人体等内单线态氧气的检测产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定，检测敏感技术背景超氧自由基阴离子superoxideradical；O2^过氧化氢hydrogenperoxide；H2O

2、羟自由基或氢氧基hydroxylradical；OH过氧化基peroxylradical；ROOD、氢过氧自由基hydroperoxy1；H00^烷氧自由基alcoxy1radical、氮氧基nitricOxide；NO、过氧亚硝基阴离子peroxynitriteanion；0N00次氯酸hypochlorousacid；HC1O、半醍自由基semiquinoneradical单线态氧气singletoxygen等细胞内活性氧族ReactiveOxygenSpecies；ROS的产生和增多，将导致细胞衰老或凋亡其中单线态氧气singletoxygen；1O2是分子氧02的抗磁形式或电激发形式通过染料分子，例如孟加拉红RoseBengal、亚甲基兰MethyleneBlue、口卜咻类化合物Porphyrins染料的光敏过程中能量转移产生，或过氧化氢和次氯酸的化学反应产生单线态氧气可以调节紫外线A辐射的生物学作用、激活各种细胞信号通路等单线态氧气会导致植物的光动力损伤photodynamicdamage和动物心血管问题基于二甲基.

4.亚硝基苯胺NN-Dimethyl-p-nitrosoaniline；PNDA或RNO作为单线态氧气的选择性受体，在单线态氧气的存在下，产生去色作用，在分光光度仪下440nm波长，呈现吸光峰值的降低据此定量检测细胞内单线态氧气活性氧族的浓度产品内容清理液ReagentA120毫升裂解液ReagentB10毫升缓冲液ReagentC20毫升反应液ReagentD2毫升阴性液ReagentE1毫升产品说明书1份保存方式保存清理液ReagentA在4c冰箱里；其余的保存在-20C冰箱里；反应液ReagentD避免光照；有效保证6月用户自备

1.5毫升离心管用于样品制备和保存的容器15毫升锥形离心管用于样品制备的容器细胞刮脱棒用于细胞脱离微型台式离心机用于样品操作培养箱用于反应孵育比色皿或96孔板用于比色分析的容器分光光度仪或酶标仪用于比色分析实验步骤

一、样品准备.准备好25cm2细胞培养瓶或60mm细胞培养皿的待测培养细胞1至5X16细胞.小心加入3毫升清理液ReagentA覆盖生长表面.小心抽去清理液.使用细胞刮脱棒轻柔刮脱细胞注意避免使用胰酶消化.加入3毫升清理液ReagentA混匀细胞.移入到预冷的15毫升锥形离心管注意、、悬浮细胞从这一步骤开始.放进4℃台式离心机离心5分钟，速度为300g.小心抽去上清液.加入500微升裂解液ReagentB充分混匀.转移到预冷的

1.5毫升离心管.强力涡旋震荡15秒.置于冰槽里孵育30分钟.放进4℃微型台式离心机离心15分钟，速度为16000g或13000RPM例如eppendorf

5415.小心移取500微升上清液到新的预冷的

1.5毫升离心管.移取10微升进行蛋白定量检测注意建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒一GMS

30030.

1.即刻放进一70C保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备.开启并设定好分光光度仪温度为30C波长440nm并置零.从一20C冰箱里取出试剂，置于冰槽里融化；反应液ReagentD避免光照.缓冲液ReagentC室温下均衡温度

三、背景对照测定.移取800微升缓冲液ReagentC到新的比色皿.加入100微升阴性液ReagentE.加入100微升反应液ReagentD.上下倾倒数次，混匀.在30℃温度下孵育40分钟.即刻放进分光光度仪检测，此为背景空对照

四、样品测定.移取800微升缓冲液（ReagentC）到新的比色皿.加入100微升待测样品（50微克蛋白）（注意样品须清.加入100微升反应液（ReagentD）.上下倾倒数次，混匀.在30℃温度下孵育40分钟.即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

五、计算样品浓度［（样品读数一背景读数）X1（体系容量；毫升）X样品稀释倍数卜［

0.1（样品容量；毫升）X

34.4（毫摩尔吸光系数）］=微摩尔।02/毫升（样品蛋白浓度）毫克/毫升=微摩尔।02/毫克

六、酶标仪测定.在96孔板上做好相应标记背景对照和样品.分别移取200微升缓冲液（ReagentC）到96孔板的所有孔里.分别加入25微升阴性液（ReagentE）或待测样品（20微克蛋白）到相应孔里（注意样品须清.分别加入25微升反应液（ReagentD）到96孔板的所有孔里.轻轻摇动96孔板.在30℃温度下孵育40分钟.即刻放进酶标仪检测获得吸光读数.浓度计算［（样品读数一背景读数）X

0.25（体系容量；毫升）X样品稀释倍数卜［

0.025（样品容量；毫升）X

34.4（毫摩尔吸光系数）X

0.6（光径距离；厘米）］=微摩尔।02/毫升♦（样品蛋白浓度）毫克/毫升=微摩尔।02/毫克注意事项.本产品为20次（比色皿）或80次（96孔板）操作.避免使用叠氮化钠处理样品.操作时，须戴手套.孵育时，避免光照.系统操作过程中，背景测定只需1次.建议使用比色皿测定.样品须澄清，至关重要.测定值由高到低变化.比色测定后，比色皿须清洗彻底.建议待测样本蛋白浓度为50微克/100微升；如果样本浓度过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒一GMS3OO3O.1）.如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度.可以使用单线态氧气抑制剂或清除剂（scavenger）即NaN3和DABC0作为抑制剂对照或阴性对照.可以使用单线态氧气激发剂（generator）即蔡咤酮酸（Nalidixicacid）等作为阳性对照.本公司提供系列活性氧检测试剂产品质量标准.本产品经鉴定性能稳定.本产品经鉴定检测敏感。