大学生创新创业训练计划申请书

大学生创新创业训练计划申请书（创新训练项目）项目编号项目名称病毒性心肌炎病原检测及溯源申报级别□国家级口省级口校级项目负责人席诗瑶联系电话―所在学院生物学院学号专业班级生物技术1802班指导教师邱烽联系电话申请日期

2020.

06.21起止年月

2020.06—

2021.03湖南大学202X年制同意推荐参评校级项目专家组组长（签章）:年月日

六、学校大学生创新训练计划专家组意见同意推荐为省级项目负责人（签章）:

七、大学生创新创业训练计划领导小组审批意见同意专家组意见负责人（签章）:填写说明.本申请书所列各项内容均须实事求是，认真填写，表达明确严谨，简明扼要.申请人应为本科生创新团队，首页只填负责人“项目编号”一栏不填.申请书（含简表）正文填写需采用仿宋GB

2312、小四号字体，单倍行距双面印刷，左侧装订成册可网上下载、自行复印或加页，注意排版和打印的美观和规范.负责人所在学院认真审核，经初评和答辩，签署意见后，将申请书报送湖南大学学生创新创业中心基本情况

二、立项依据（可加页）

（一）项目简介病毒性心肌炎是我国较常见一种临床疾病，前期对少数样本的检测表明，病毒性心肌炎取样患者心肌细胞内含有人细小病毒B19（HPVB19）本项目在此成果的基础上，利用高通量测序手段进一步对大量样本进行测序，以明确样本中HPVB19核酸序列、含量等具体情况之后通过聚合酶连反应（PCR）对样本HPVB19进行全基因组测序并利用测序结果进行进化溯源，以探究该病毒的突变、进化以及世界各地区HPVB19之间的亲缘关系

（二）研究目的

1、通过高通量测序法明确样品中HPVB19的核酸序列、含量情况

2、探究HPVB19的进化以及世界各地区该病毒的亲缘关系

3、探究HPVB19的突变规律，为之后该病毒可能出现的突变以及潜在风险提供研究依据

（三）研究内容

一、高通量测序部分

1、实验样品的选取利用实验室已有的样品北京阜外医院心肌炎病人心肌样品43例对照组选择非心肌炎病人心肌样品20例

2、利用SwordofViralMetagenomics（SVM）技术对心肌炎患者心肌样品进行病毒宏基因组学研究

（1）将组织样品中病毒浓缩

①取心肌样品100mgImlPBS震荡研磨后离心去除残渣

②在离心管中铺满蔗糖，将过滤后的上清液缓慢加入离心管中，再离心后去掉上清后，将沉淀与DNase和Rnasefree共同保存

（2）核酶消化将Samplel74ul、DNaseI5ul10XDNaseIBuffer20uLRNaseA工作液lul混合，在37℃下孵育Ih后，进行RNA提取

（3）核酸提取使用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒（DP315）对样品中的核酸进行提取

（4）通过提取到的DNA/RNA进行反转录，逐步合成sscDNA、dscDNAo并对得到的cDNA进行备份和特异性PCR检测

（5）通过PCR技术进行单引物扩增DNA检验取PCR产物进行电泳，观察条带进行检验将PCR产物按照乙醵沉淀法进行纯化回收并用NanoDrop进行检测确定其质量

（7）测序通过电泳和NanoDrop检测合格后，多次单引物扩增回收直至总量达到5Hg送至公司测序

（8）序列信息分析过滤其中的低质量序列和较短序列，将处理后的序列进行比对，得到样品中所含病毒种类信息

二、HPVB19溯源部分

1、获取HPVB19病毒毒株

2、采用PCR技术对PVB19进行全基因组扩增测序

3、获得全基因组测序结果后，查阅资料获得国外PVBI9基因序列，进行对比得病毒亲缘关系，作出进化树图谱

（四）国、内外研究现状和发展动态引发心肌炎的众多诱因中，病毒感染已被研究证明是心肌炎最普遍的诱因⑴已有研究人员通过聚合酶连反应（PCR）和病毒性特异性原位杂交技术，在临床疑似病毒性心肌炎患者的心肌标本内检测到大量病毒基因组，包括肠道病毒（如柯萨奇B组病毒、埃可病毒等）、腺病毒、细小病毒B19（PVB19）、流感病毒、人类疱疹病毒（HHV）、巨细胞病毒、艾滋病毒（HIV）等⑵文献表明B19病毒被分为3个基因型口用其中基因1型，包含绝大部分发现的B19病毒株，如Au、J35；基因2型主要代表病毒株为LaLi、A6等；基因3型主要代表病毒株为D

91.1和V9o研究表明，1型的分布呈全球性；2型已经几乎消失，只在欧洲、巴西和美国有极低的检出率；3型通常只流行于西非的加纳，但也已在巴西、法国、印度和美国被发现⑸每种基因型的患病率随地理来源、人口和样本类型的不同而不同，PVB19基因型有着区域分布性，目前各基因型以及亚型之间的突变、进化以及亲缘关系还有待进一步研究I.KindermannC.BarthF.MahfoudC.UkenaM.LenskiA.YiImazK.KlingelR.KandolfU.SechtemL.T.CooperM.Bohm.UpdateonMyocarditis]/.JournaloftheAmericanCollegeofCardiology

2012599.K.KarinS.MartinaB.C.ThomasS.GudrunS.Jens-JorgK.Reinhard.Molecularpathologyofinflammatorycardiomyopathy.[J].Medicalmicrobiologyandimmunology20041932-

3.QiuJMSoderlund-VenermoMYoungNS.Humanparvoviruses.ClinMicrobiolRev2017301:43-

113.Servant-DelmasALefrereJJMorinetFetal.AdvancesinhumanB19erythrovirusbiology.JVirol20108419:9658-

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247.五创新点与项目特色

1、普通的病毒测序方法有测序耗时长、成本高、通量低等缺点，本项目创新性地使用以高通量测序为基础的SVM技术对实验样品进行检测，该方法的优越性主要体现在一次可对大量样品进行检测以及备份和质控步骤的引入上——极大提高了样品处理的准确性，并且使过程中出现的问题可视化

2、在此次的新冠疫情中，常利用对新发地区病例的病毒核酸序列检测来查明病例的可能来源，为疫情防治提供一定的基础，因此对于病毒的溯源十分有意义本项目创新型地对PVB19进行进化溯源，研究该病毒在不同地区流行基因型之间的关系，以探究PVB19核酸序列的进化、突变以及亲缘关系该项目的实验结果可为之后该病毒可能出现的突变以及潜在风险提供研究依据六技术路线、拟解决的问题及预期成果技术路线获取病毒性心肌炎样本并提取核酸口送检，利用高通量测序法检测样本中病毒核酸序列与NCBI的非冗余蛋白库进行BLAST比对，进•步验证病毒性心肌炎内主要毒株为HPVB19获取HPVBI9毒株利用全基因组扩增技术（WGA）对基因序列进行扩增将HPVB19的基因组序列与国外其他地区的基因组序列进行对比，对其亲缘关系进行分析拟解决的问题

1、病毒性心肌炎患者心肌样品中的主要毒株类型为HPVB19在大多数样品中的验证

2、HPVB19基因型突变、进化及各地区亲缘关系的查找对比预期成果:

1、验证PVB19为取样患者心肌样品中的主要毒株

2、根据所测得HPVB19全基因组序列，对比得出不同地区流行的HPVB19基因突变、进化及亲缘关系

（七）项目研究进度安排（分年度写）

2020.8-

2020.9获取病毒性心肌炎样本并提取核酸将样本进行高通量测序-12将高通量测序结果与NCBI的非冗余蛋白库进行BLAST比对，找出主要毒株HPVBI9将HPVBI9进行全基因组测序

2021.01-02查阅文献获得世界其他地区HPVB19核酸序列，对该病毒进行基因突变、亲缘关系分析

2021.03实验结果总结

（八）已有基础

1、与本项目有关的研究积累和已取得的成绩

（1）前期在少数心肌炎患者样品检测中，取样患者心肌细胞中含有HPVB

192、已具备的条件，尚缺少的条件及解决方法

（1）已具备条件实验室具有北京阜外医院心肌炎病人心肌样品43例和非心肌炎病人心肌样品20例作为高通量测序的样本

（2）尚缺少的条件进行高通量检测和全基因组测序检测条件

（3）解决方法将高通量测序样本和HPVB19毒株样本检验合格后送至生物公司进行测序

三、经费预算注经费开支科目包括业务费（计算、分析、测试费，学术会议费，调研差旅费，文献检索费论文出版费）、实验设置试制费、材料费等

四、指导教师意见项目创新性强，设计合理，有良好的可行性，同意该对以该项目参与SIT比赛导师（签章）:

五、学院大学生创新训练计划专家组意见目称项名病毒性心肌炎病原检测及溯源项目所属专业类理科申请金额17000元起止年月2020年6月-2021年3月负责人姓名席诗瑶性别女民族汉族出生年月

2000.

03.10学号联系方式手机指导教师邱坤个人信息职称助理教授学历博士E-mail:负责人曾经参与创新创业的情况参加第四届生命科学竞赛，小组项目为研制基于甲型流感病毒M2e的广谱疫苗与初步保护机制研究指导教师承担科研课题情况承担国家自然科学基金青年项目一项湖南省自然科学基金青年项目一项指导教师对本项目的支持情况支持提供课题指导，实验场地，实验样品和相关的试剂耗材项目组主要成员姓名学号手机号所在学院项目中的分工杨雨潼生物学院实验与进度安排席诗瑶生物学院实验与核对开支科目预算经费主要用途阶段下达经费计划（元）（元）前半阶段后半阶段预算经费总额

17000750095001.业务费1130040007300

（1）计算、分析、测试费7800用于病原测序和全基因测序37004100

（2）能源动力费0

（3）会议、差旅费500用于样品送检等过程的交通300200

（4）文献检索费0

（5）论文出版费3000用于发表论文

030002.仪器设备购置费

03.实验装置试制费

04.材料费5700用于购买实验样本、病毒样品等35002200批准经费。