最新：补骨脂盐炙前后对去卵巢大鼠的骨保护作用及其机制

最新补骨脂盐炙前后对去卵巢大鼠的骨保护作用及其机制摘要目的比较补骨脂盐炙前后对去卵巢（OVX）大鼠骨质疏松的治疗作用并探讨其炮制机理方法制备大鼠骨质疏松模型，分别用补骨脂生、盐品灌胃，给药12周后称重取子宫，测血清中钙（Ca1磷（P入碱性磷酸酶（ALP）、骨钙素（0C）以及雌二醇（E2）含量，测骨生物力学强度和骨密度（BMD）观察骨小梁微结构制备补骨脂生、盐品含药血清检测含药血清对成骨细胞增殖和分化影响检测补骨脂生、盐品水煎液和含药血清中主要有效成分含量结果补骨脂生、盐品均能有效抑制去卵巢所致的大鼠体重增加和子宫萎缩，升高血清Ca、P含量，降低ALP、0C和E2含量，显著提高BMD、骨生物力学强度，改善骨小梁结构的完整性补骨脂生、盐品对成骨细胞的增殖和分化均有明显的促进作用，且盐品效果优于生品此外，补骨脂盐炙后有效成分的煎出和入血成分的含量存在明显差异结论补骨脂生、盐品对OVX所致的大鼠骨质疏松症有良好的治疗效果，并且补骨脂盐品的抗骨质疏松作用更强，这与补骨脂盐炙促进补骨脂甘、异补骨脂苗等有效成分煎出和盐炙后补骨脂素、异补骨脂素等入血有效成分增加有关关键词补骨脂；盐炙；骨质疏松；去卵巢大鼠；成骨细胞；动物实验骨质疏松症是一种系统性骨骼疾病，其特征为骨密度降低和骨微结构破坏［1］临床上常用的抗骨质疏松药主要有基本补充剂、抑制骨吸收药和促进骨形成药这几大类然而目前这些药物疗效有限，同时伴有许多不良反应0补骨脂（PsoraleacorylifoliaL.）有补肾壮阳、温脾止泻之效，临床常用于治疗骨性疾病和白瘢风等皮肤病，在中国和亚洲其他国家已有数百年的使用历史［3］中医临床常将补骨脂盐炙后入药，根据传统的中药炮制〃盐炙入肾〃理论，盐炙可以引药下行，促进中药成分进入肾经〃，增强其温肾作用⑷，而肾主骨肾充则髓实因此，补肾益髓”的基本治则在中医骨科临床上得到广泛应用［5］实验从补骨脂临床实际用药出发，采用传统水煎剂给药，比较补骨脂生品、盐品抗骨质疏松作用的同时，分析补骨脂盐炙前后化学成分在体内外的变化，探究其炮制机理1材料与方法样品准备补骨脂购于北京同仁堂（产地四川，批号180501）补骨脂盐品按照《中华人民共和国药典》（2015版IV部）的指导原则进行加工生品和盐品打粉，过筛分别称取粉末500g加入5000mL蒸储水提取1h过滤，浓缩，补骨脂调整最终浓度为

0.2g/mL0动物SPF级雌性SD大鼠（合格证:20180004033817;伦理审查编号201903A011），体重220〜260g由南京中医药大学实验动物中心提供13去卵巢大鼠模型的建立40只大鼠随机分为4组假手术组（sham）、去卵巢（OVX）组、生品组和盐品组大鼠麻醉，于脊柱两侧做纵向切口，切去双侧卵巢假手术组打开腹腔后仅切除卵巢附近大小相近的一团脂肪组织，保留完整卵巢给药及样本采集术后4周，给药组每天分别以

0.4g/200g体重（约人临床用药剂量的2倍）补骨脂生、盐品灌胃，其余两组给予生理盐水12周后记录大鼠体重，采集血液、子宫、股骨和胫骨血清生化标志物的检测ALP、Ca、P采用生化试剂盒检测（Beyotime，上海，中国）;0C、E2用ELISA试剂盒检测（南京建成生物工程研究所，南京，中国工

1.6生物力学强度的测试每组随机抽取右侧的股骨和胫骨样本（n=5）进行三点弯曲实验Instron5566;InstronCorp.USA\骨密度测量每组随机抽取左侧股骨和胫骨样本（n=5）用小动物骨密度测试软件RegionHighResolutionVersion4076;HOGIC测定左侧骨远端的骨密度Micro-CT骨微结构分析每组随机抽取左侧股骨样本n=5进行CT扫描CT-SharpZKKS-MCT中国ZKKS-MCT补骨脂含药血清的制备30只大鼠随机分为3组对照组、补骨脂生品、盐品组给药组每天分别以

0.4g/200g体重灌胃，对照组给予生理盐水第7天给药2h后，取血血样于室温静置1h3600r/min10min取上清将收集到的血清于56℃灭活30min，保存于-80℃o成骨细胞增殖及代谢的血清生化标志物测定从刚出生的Wistar大鼠颅骨上提取成骨细胞并培养种板24h后，分别加入5%、10%、20%的补骨脂生、盐品的含药血清和空白血清，继续孵育

12、

24、48h后检测细胞增殖率和培养液中ALP活性每个实验独立进行3次补骨脂生、盐品主要有效成分的体内外含量测定体外水煎液含量测定取生、盐品粉末各

0.5g加50mL水提取1h0过滤并蒸发溶剂，甲醇复溶，转移至10mL容量瓶中，定容平行3份用高效液相色课HPLC狈!]254nm处成分含量Waterse26952998UVUSA0色谱柱:HypersilODS2250mmx

4.6mm5pm;流动相:水A甲醇Band乙睛C大鼠体内含药血清测定每组随机抽取5份血清加入甲醇和内标，涡旋3min12000r/min5min取上清氮气吹干加甲醇复溶混匀3min12000r/min5min取上清用UPLC-TripleQuad5500进行分析正离子模式的电喷雾电离源色谱柱ExtendC18AgilentUSA

2.1mmxWOmm

1.8|im;流动相:

0.1%甲酸A和乙睛B\

1.12统计学处理使用SPSS

25.0软件SPSSInc.ChicagoUSA进行统计分析2结果体重和子宫指数的测定如图1A所示，OVX组的体重明显高于假手术组P

0.01；给药后大鼠体重明显下降，生、盐品之间没有显著性差异P

0.051图1B显示，OVX组子宫指数［子宫重量mg/体重g］远低于假手术组P

0.01，给予补骨脂生品后，子宫指数上升P

0.05盐品组的子宫指数有上升趋势，但差异无统计学意义P

0.05\实验结果提示，去卵巢之后，大鼠体内激素紊乱，机体负反馈调节，导致食欲增大，体重代偿性增加，而补骨脂抑制了去卵巢引起的体重代偿性增加，生、盐品作用相当同时由于雌激素减少，子宫功能受到影响，子宫萎缩甚至功能消失，子宫指数降低，补骨脂生品可以刺激子宫，明显增加子宫重量，而盐品也有同样的作用趋势，但趋势不明显补骨脂对OVX大鼠血清生化标志物的影响OVX组血清生化指标均有显著变化P

0.01而补骨脂在一定程度上逆转了OVX诱导的各种病理性变化生、盐品对各生化指标的影响相同无显著性差异P

0.050补骨脂对OVX大鼠骨密度的影响OVX大鼠的股骨和胫骨的骨密度均明显低于假手术组P

0.01给药后大鼠的骨密度显著增加，且补骨脂生、盐品对骨密度的影响相似差异无统计学意义p

0.05x补骨脂对OVX大鼠生物力学强度的影响如表2所示，与假手术大鼠相比，OVX组的股骨和胫骨的最大载荷和杨氏模量显著降低补骨脂盐品能显著增加股骨和胫骨的最大载荷P

0.01而生品有增加骨最大载荷的趋势，但作用不明显P

0.050补骨脂生、盐品均可以增加股骨和胫骨的杨氏模量，两者对胫骨的影响作用相同，没有显著差异P

0.05，但对股骨的影响有差异，盐品对股骨的作用优于生品P

0.05\图片补骨脂对OVX大鼠骨小梁微结构的影响各组股骨干能端骨小梁的3D结构图像如图3所示结果显示补骨脂给药后力\梁微结构明显改善与假手术组相比QVX组骨小梁较薄断裂较多生品组和盐品组骨小梁网比0Vx组多，断裂减少补骨脂含药血清对大鼠成骨细胞增殖和分化的影响补骨脂含药血清孵育12h和24h对细胞增殖无明显影响数据未显示工在图4A中，各浓度含药血清作用48h后均显示出明显的细胞增殖活性，在相同浓度下，补骨脂盐品的含药血清对成骨细胞的增殖作用优于生品P

0.05\随着含药血清浓度的增加，成骨细胞增殖率有上升的趋势，但趋势不明显，无显著差异P

0.05\如图4B所示，5%、10%和20%的补骨脂盐品含药血清均可显著增加ALP活性，促进成骨细胞分化，而补骨脂生品含药血清仅在中、高浓度时才对ALP活性有影响，低浓度时无明显作用P

0.05X生、盐品含药血清对ALP活性的影响与其浓度呈正相关P

0.01，含药血清浓度越高，ALP活性越大图片补骨脂中主要有效成分体内外含量测定补骨脂中主要有效成分补骨脂素、异补骨脂素及其苗类成分的体内外含量测定结果见表3盐炙后，补骨脂水煎液中苗类成分含量高于生品P

0.01而相应的苜元含量减少P

0.01而且补骨脂盐品水煎液中的昔和昔元的含量总和大于补骨脂生品补骨脂盐品含药血清中补骨脂素和异补骨脂素含量显著高于补骨脂生品P

0.01X图片3讨论本实验中，OVX大鼠体重增加，子宫萎缩，BMD降低、骨骼变脆、结构受损，雌激素下降以及血清生化指标水平紊乱等一系列变化均与临床绝经期妇女骨质疏松的症状一致［6］而补骨脂生、盐品均可在不同程度上逆转由去卵巢引起的大鼠体内外各种生化指标及骨骼的变化，降低去卵巢对大鼠的影响，表现出一定的抗骨质疏松作用，且补骨脂生、盐品的含药血清均可以促进成骨细胞增殖和分化，促进骨基质的分泌，加速骨形成盐炙前后的补骨脂治疗骨质疏松的效果和机制均很相似，但总体而言补骨脂盐品在诸多指标上的作用均优于生品补骨脂盐品增加骨硬度和骨韧性的效果显著，促进成骨细胞增殖和分化的作用也明显优于生品绝经期骨质疏松症的主要原因就是体内雌激素减少，不足以抑制破骨细胞活动，骨合成减少，最终导致骨量减少，骨脆性增加，骨折风险也随之增加［7］这意味补骨脂盐品在促进成骨细胞增殖和分化，从根源上治疗骨质疏松的同时，还可以增加骨硬度和骨韧性，降低骨折风险，在对症〃和对因两个方面均优于生品补骨脂盐炙前后的主要有效成分的煎出含量存在差异，吸收入血的有效成分含量也存在差异补骨脂盐炙增效，增加其抗骨质疏松作用的机制可能有1盐炙过程杀酶保昔，破坏了酶的活性，从而保留了补骨脂甘、异补骨脂苗等昔类成分［8-9］而昔类成分易于煎出，吸收入血后又可被代谢成为相应的补骨脂素、异补骨脂素等苜元［10］导致含药血清中药效成分含量的高于生品，从而提高了疗效；2盐炙促进补骨脂中有效成分吸收和代谢增加其生物利用度口1］；3〃盐炙入肾，即盐炙可以引药下行，专入肾经，促进补骨脂中药效成分吸收入肾［12］而〃肾主骨〃肾充则髓实，骨的生成、发育和强弱与肾息息相关，从而达到盐炙增效的目的［13］然而，补骨脂在临床使用也存在较多的不良反应报道［14］不能忽略其临床毒性，如肝、肾和光毒性补骨脂的毒性作用与剂量具有一定相关性，试验中补骨脂剂量越大，毒性程度越明显［15］炮制［16］和配伍［17］在一定程度上也可以降低补骨脂的毒性中医临床用药讲究的是君、臣、佐、使相辅相成，对中药毒性的研究应综合、科学地进行整体评判口8］综上所述，补骨脂生、盐品均可促进大鼠成骨细胞增殖和分化，加速骨形成，具有较好的抗骨质疏松作用而盐炙可以增加补骨脂有效成分补骨脂昔、异补骨脂苗等昔类成分的煎出和补骨脂素、异补骨脂素等昔元成分的吸收入血，增强了补骨脂盐品抗骨质疏松的疗效参考文献略。