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酶免疫分析
一、原理酶免疫分析enzymeimmunoassayEIA的原理与RIA和IRMA相同,不同的是用酶替代放射性核素标记抗原或抗体,经竞争性或非竞争性免疫结合反应,产生的免疫复合物,其中的酶催化特定底物,生成有色产物,可根据有色产物的吸光度不同来对受检样品作定性或定量分析常用的酶标记物有辣根过氧化物酶horseradishperoxidaseHRP用于EIA的主要是HRP的C型同工酶HRP首先与丛2结合形成活泼的“氧化剂”,再催化底物氧化生成显色产物HRP的常用底物有邻苯二胺OPD、5-氨基水杨酸5-ASA、四甲基联苯胺及其硫酸盐TMB、TMBS邻联甲苯胺0T等碱性磷酸酶alkalinephosphataseAP AP系水解酶,将不同的磷酸酯水解使之成为有色产物常用底物为对硝基酚磷酸酯p-NPP、酚猷单磷酸酯phenolphtheleinmonophosphateo有以下各类EIA一按免疫反应后,是否分离结合抗原B和游离抗原F可分成.均相EIA又称酶检测免疫分析技术enzymemonitoredimmunoassaytechniqueEMIAO酶与半抗原结合为酶标半抗原,与被测半抗原竞争地与抗体结合,标记抗原与抗体结合后,酶的活性即被抑制,因此不需加入分离剂,直接测定游离酶标半抗原的酶活性即可推算被测半抗原的量EMIA主要用于小分子抗原或半抗原的定量如激素、药物或毒品等的分析.异相EIA酶标抗原或抗体与标本中的待检抗体或抗原结合,分离除去未结合酶标抗原或抗体后,加入酶底物显色即可作定性或定量分析常用固相分离法,又称为酶联免疫吸附分析enzymelinkedimmunosorbentassayELISA与均相EIA相比,该法应用范围较广,可标记各种抗原和抗体二根据所用固相物质不同又可分为.板式ELISA全部反应和比色都在塑料微孔板中进行目前国际通用8X12的96孔板.管式ELISA用小管作为反应容器和比色管,反应体积大,比色光径长,可在一定程度上提高检测灵敏度.小珠一般直径为6mm吸附面积明显增大
(三)按抗原抗体结合方式可分成.竞争性结合酶免疫法标记抗原与待测抗原竞争地与抗体相结合.非竞争性结合酶免疫法抗原抗体之间的反应不存在竞争性1)直接ELISA酶标记抗体与待测抗原非竞争性结合,再与固相载体形成复合物称双抗体夹心法,常用于测定较大分子抗原2)间接ELISA酶标记的第二抗体作为一种通用试剂,可与任何第一抗体结合现以应用最为广泛的ELISA为例加以说明
二、试剂组成.酶标抗体(抗原)要求酶稳定不失活,42可保存数月.固相抗体(抗原)聚苯乙烯微孔条,透明度高,吸附性能好,材质均匀,孔间差异小包被抗原纯度高,包被抗体效价高,亲和力强,4(、密封、避光、干燥的环境中保存,一般可保存6个月.底物底物应稳定,易于保存OPD为白色粉末,易于氧化并对光敏感,应密封保存于棕色瓶内,4干燥环境下存放,临用前配制而TMB配制后密封保存在棕色瓶内,4T可存放半年.结合物和标本的稀释液稀释液中常加入高浓度的无干扰作用的蛋白质(如10g/LBSA或50g/L脱脂奶粉),一般还含有
0.05%非离子表面活性剂如Tween20可抑制蛋白质在塑料表面的非特异性吸附.洗涤液常用含
0.05%Tween20的PBSO.酶反应终止液常用2mol/L硫酸.校正试剂参见时间分辨荧光免疫分析.质控血清参见放射免疫部分
三、检测条件和方法(-)仪器设备专用微量加样器、加样头、平板震荡器、水浴箱或孵箱、洗板机、酶标仪全自动酶联免疫分析系统,可精确控制反应条件,结果更为可靠
(二)样品采集、处理和储存见放射免疫部分
(三)检测方法以CanAg公司NSE检测试剂盒为例,其免疫反应原理为生物素-链霉亲和素参与的双抗体夹心法(生物素-链霉亲和素系统原理参见电化学发光部分),具体检测程序如下.将25R1样品或标准品按顺序加入链霉亲和素包被的微孔条中.每孔加入lOOul单抗工作液(含IIRP标记抗NSE单抗和生物素标记抗NSE单抗),形成生物素-抗体-抗原-抗体-HRP免疫复合物,并通过生物素-链霉亲和素的特异性结合固定于微孔内壁.室温孵育Iho.洗涤微孔条并在滤纸上拍打除去残留洗涤液,重复6次,以去除游离的或抗体
5.加底物应用液(包含TMB和H2O2)震荡反应30min
6.加终止液,混匀后在酶标仪上读取0D值,按要求作数据处理,得出结果
(四)资料保存及报告要求参见时间分辨荧光免疫分析
(五)质量控制见放射免疫部分
四、注意事项.HRP对金属污染物很敏感(甚至不能使用金属的加样器),因此对试剂和试验用水的要求较高,应用新鲜的蒸储水或去离子水但通过聚苯乙烯树脂得到的无离子水常影响HRP活力,如果不使用Tween20作固相载体用的聚苯乙烯板也可影响HRP活力另外,HRP对细菌及抑菌剂如NaM特别敏感,因此用NaM防腐的标本不可用于HRP标记的一步法ELISA;试验用水中的氧、次氯酸、芳香族的氯碳化合物都会影响HRP的活力此外应注意乩2不仅是HRP的底物,也是HRP的抑制剂,过量的上2对固相HRP的抑制作用比游离HRP更明显,因此HRP的浓度应维持在
0.01%〜
0.03%之间同时,上2易挥发,放置过久引起浓度降低,可使0D值降低.0PD可能有致癌作用,故目前倾向用TMB代替0PD.AP有两种来源牛的肠黏膜和大肠杆菌,二者的最佳酶活度的PH值不同,前者为pH10后者为pH8o无机磷酸盐是AP的强抑制剂,因此试验中应避免使用PBS液;金属络合剂如EDTA也是AP的强抑制剂,应注意避免.孵育最好在水浴中进行,ELISA板底应贴着水面,使温度迅速平衡,各板不可重叠,板上应加盖防止蒸发如在孵育箱中反应,应将板置于湿盒中。