肝胆肿瘤类器官培养用主要试剂材料与操作要点、STR、染色体核型检测、鉴定、类器官的核酸与蛋白质提取

附录A（资料性）肝胆肿瘤类器官培养用试剂材料与操作技术要点1主要试剂材料培养基主要构成表A.1肝胆肿瘤类器官培养基的主要成份表*根据肿瘤样本和细胞本身存在的的heterogeneity样本量足够大时可考虑调整成分，浓度看哪个条件更适合样本的培养类器官培养3D支架材料3D基质胶提取自基底膜的基质，主要由层粘连蛋白、IV型胶原、巢蛋白、硫酸肝素糖蛋白等组成10还包含生长因子和基质金属蛋白酶等基质胶在室温条件下聚合形成具有生物学活性的三维支架，模拟体内细胞外基质的结构、组成、物理特性和功能该结构不仅有利于体外细胞的培养和分化，而且能够为胃肠道上皮细胞的生长提供支架基质胶在零度以下低温环境呈液态，故凡是涉及基质胶的试验操作皆应置冰盒操作组织消化酶肝脏组织消化中涉及的消化酶主要有IV型胶原酶CollagenaseIV与DNaseL其作用是水解肝脏ECM中的胶原蛋白成分，从而使肝脏细胞从组织中充分分离出来，以利于制备为单细胞悬液类器官冻存液类器官冻存液为无血清冻存液，一般宜含有10%的二甲基亚碉DMSOo2肝脏类器官培养操作要点类器官污染的处置肝脏类器官培养过程中应定期观察、拍照一般在第2天于倒置显微镜下可以观察到类器官小球，随着培养时间延长，类器官小球逐渐增多、增大定期观察有利于及时发现污染如果在培养3天内出现基质胶浑浊，提示可能有霉菌和细菌污染，应及时做丢弃处理在类器官培养过程中也有可能出现支原体污染支原体在培养基上呈现团状、小球状生长，容易与类器官混淆，但支原体在显微镜下观察不到上皮的组织细胞结构若发现可疑支原体污染，可加入支原体去除剂进行挽救，支原体去除剂可以抑制并消除支原体的生长，若仍不能去除支原体污染则做丢弃处理类器官培养物接种注意事项将获取的细胞悬液与3D基质胶按照1:1混匀吹打，吹打过程中切忌产生大量气泡，以免影响后续培养物接种24孔板可提前于37℃培养箱预热30min以加速3D基质胶的凝固类器官传代注意事项肝脏类器官可以连续传代超过10代或持续培养6个月以上与类器官有关的试验研究宜在连续传代10代以内或者持续培养6个月内进行3类器官冻存注意事项冻存前每孔力「入500|11的organoidharvestingsolution将类器官吸至试管内，按照50可胶加500111的organoidharvestingsolution置于冰上60min去除基质胶，离心清洗后，加入Accutase消化3-5min使其消化成单细胞悬液，lOOOrpm离心5min弃上清后加入适量类器官冻存液混匀1ml左右，分装于500川低温冻存管中，放入程序性冻存盒内于-80C深低温冰箱过夜保存，次日将冻存管转移至液氮罐中长期保存4类器官复苏注意事项从液氮罐中取出的类器官冻存管要应快速放入37c水浴锅中令其尽快融化吸出类器官冻存物移至15ml无菌离心管中，再加入10倍体积的AdvancedDMEM/F12培养基混匀之后操作同前述的类器官传代培养过程附录B（资料性）STR检测首先了解下STR检测流程，先提取细胞DNA然后进行PCR扩增及测序，最后进行结果分析详细检测流程请看下图人源类器官STR鉴定结果判定标准:受检类器官STR位点的基因分型数据与其对应的标准细胞系（其原始组织或衍生细胞系）STR基因分型数据进行比对1若两者的匹配度N80%则判定受检细胞系为标准细胞系或为标准细胞系的衍生细胞系2若两者的匹配度在56%-80%之间，建议结合细胞系形态、细胞系特异性标记物等辅助分析进行综合判断3若两者的匹配度W56%则判定受检细胞样本与其对应的标准细胞系不相关附录C（资料性）染色体核型检测.试验当天保证细胞处于对数生长期，一般一个6cm的培养皿80%的密度能做一次试验.将待测细胞从37℃5%CC）2培养箱中拿出，添加秋水仙素（终浓度为

0.2ug/ml）摇匀后37℃孵育1-2小时3等待的同时，配制低渗溶液

0.075MKCL（配制:8ml无菌水+

44.7mgKCL）放入37c水浴预热孵育后的细胞用胰酶消化，1200转/分，离心5min收集于离心管中，去除上清液，用8ml低渗液重悬打匀后放37℃水浴箱40min.加入新鲜配制的固定液（甲醇/冰乙酸=2/1〜3/1）2ml混匀，室温下放lOmin后，1000转/分离心lOmin去上清液（留500ul先将底部细胞吹匀），新加入8ml固定液，1200转/分，离心lOmin重复三次后，滴片，放入80c烘箱老化3小时.再将烤干的玻片放入新鲜配制的胰酶（

0.25%）中消化Imin（严格控制时间）后，再放入吉姆萨染液中染色5-10分钟（先用1片染5min根据颜色调整后面的染色时间），取出用流水冲去染液后，在显微镜下观察结果附录D（资料性）肝胆肿瘤类器官鉴定1类器官显微镜下状态评估将肝胆肿瘤类器官培养皿置于倒置显微镜下，在20倍视野下计数类器官数目类器官数目不少于60个/视野表明类器官生长状态良好生长活力好的类器官平均直径约为160|im-200|im若个别类器官体积过大（可达1000（im）则提示类器官趋向衰老，应尽早传代，以防止衰老的类器官影响类器官传代2类器官存活率评估肿瘤组织消化肝脏肿瘤组织酶解后获得单细胞悬液，采用台盼蓝（Trypanblue）染色进行活细胞计数将离心后的细胞沉淀用AdvancedDMEM/F12培养基重悬（约lOOul）经吹打均匀后吸取18口1置于

1.5ml的EP管，向EP（eppendorf）管中加入2口1的

0.4%的台盼蓝染液充分混匀，染色3min取10口1细胞悬液加入血细胞计数板，在倒置显微镜10义物镜下计数，分别计数四大格中未染成蓝色和染成蓝色的细胞总数利用如下公式计算每100P1体积中细胞总数和细胞存活率总数/100u1=（（未染成蓝色细胞数+蓝色细胞数）/4）义103X

1.11细胞存活比例二未染成蓝色细胞数/（蓝色细胞数+未染成蓝色细胞数）X100%活细胞比率应＞90%可用于类器官细胞培养类器官传代及冻存复苏类器官传代前、酶解为8-10个细胞的小细胞团后以及类器官复苏后，应用LIVE/DEAD®细胞成像试剂盒测定类器官细胞群中的活细胞（绿色）和死亡细胞（红色）组分，荧光显微镜拍照统计分析存活率3肿瘤类器官的形态学及免疫标记鉴定肝胆肿瘤组织或者肝胆肿瘤类器官成功构建后，通过制备冰冻切片或者石蜡包埋切片，进行苏木素/伊红染色（HE）进行形态学鉴定，通过免疫荧光或者免疫组化染色进行生物标志物检测肝细胞标志物HNF4a干性细胞标志物S0X

9、LGR

5、EpCAM等，增殖标志物Ki

67、肝细胞标志物HNF4a、成熟肝细胞标志物ALB和CYP3A4等，肝胆肿瘤标志物AFPCA19-9CK-19CEAGSHSP70TBX3GPC3MUC1IL-6IDH1/2等，紧密连接蛋白ZO-1同时进行类器官整体染色培养大小约100-200um的类器官，加入organoidharvestingsolution置于冰上放置lh以溶解基质胶，预冷PBS漂洗类器官，低速离心（600rpm）2次力口入

0.125%TritonX-100破膜液，室温作用lOmin室温PBS漂洗3次后封闭用血清（10%二抗血清）封闭lh将类器官分别放置相应染色组别的共聚焦小室中，10%二抗血清作为配制一抗的稀释液，根据不同稀释比配制一抗抗体组合滴加一抗，4c孵育过夜后PBS漂洗3次不同组别分别滴加各种荧光标记的二抗，室温避光作用lhPBS漂洗3次后加入DAPI衬核液，室温作用lOmin后PBS漂洗3次加入水性封片剂，避光湿盒保存，共聚焦显微镜下观察采集图像并三维重建类器官结构附录E资料性类器官的核酸及蛋白质提取1类器官的核酸与蛋白质提取类器官需要先消化制备为细胞悬液，然后在11200*离心1min弃上清，加200似悬浮细胞缓冲液GA振荡使细胞彻底悬浮；加入20M蛋白酶KProteinaseK溶液，混匀；再加入200川核酸与蛋白分离缓冲液GB充分颠倒混匀，70℃放置lOmin溶液应当变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠；L4加入200M无水乙醇，充分振荡混匀15sec此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠；将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中吸附柱放入收集管中，13400xg离心30sec倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中；向吸附柱CB3中加入500|11去除蛋白质杂质缓冲液GD已按照说明加入无水乙醇，13400xg离心30sec倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600gl去盐漂洗液PW已按照说明加入无水乙醇，13400xg离心30sec倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中；重复操作步骤

1.7；将吸附柱CB3放回收集管中，13400xg离心2min倒掉废液将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200的DNA洗脱缓冲液TE室温放置2-5min13400xg离心2min将溶液收集到离心管中RNA提取收集细胞待类器官长到一定的数量后，将24孔板中的培养基去除，加入1ml的PBS进行清洗1遍去除PBS后，加入1ml的无动物源性重组胰酶，并用1ml量程的移液枪将基质胶打散，以利于消化酶与类器官进行充分的接触与消化30min后，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中离心300xg5min收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清；裂解处理轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RL35011旋涡震荡；将所有溶液转移至过滤柱CS上过滤柱CS放在收集管中，134xg离心2min收集滤液；向滤液中加入1倍体积70%乙醇通常为350可或600川，混匀此时可能会出现沉淀，得到的溶液和沉淀一起转入吸附柱CR3中吸附柱CR3放入收集管中，13400xg离心30-60sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入350可去蛋白液RW113400xg离心30-60sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；DNaseI工作液的配制取10川DNaseI储存液放入新的RNase-Free离心管中，加入70山去除DNA缓冲液RDD轻柔混匀；向吸附柱CR3中央加入80m的DNaseI工作液，室温放置15min；向吸附柱CR3中加入35011去蛋白液RW113400xg离心30-60sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；向吸附柱CR3中加入500|11漂洗液RW按照说明加入乙醇，室温静置2min13400xg离心30-60sec倒掉收集管中的废液，将吸附柱CR3放回收集管中；重复步骤

2.9；离心13400xg2min倒掉废液将吸附柱CR3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CR3转入一个新的RNase-Free离心管中，加入30-100plRNase-FreeddH2O室温放置2min离心13400xg2min得至“RNA溶液蛋白质提取收集细胞待类器官长到一定的数量后，将24孔板中的培养基去除，加入1ml的PBS进行清洗1遍去除PBS后，加入1ml的无动物源性重组胰酶，并用1ml量程的移液枪将基质胶打散，以利于消化酶与类器官进行充分的接触与消化30min后，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中离心300xg5min收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清；裂解处理轻弹离心管底部，使细胞沉淀松散，加入适量裂解液RIPA50|il/L及蛋白酶抑制剂，旋涡震荡，将其转移至EP管中，置于冰上裂解30min；蛋白收集离心4℃12000xg15min收集上层蛋白溶液；蛋白定量使用BCA试剂盒进行蛋白定量；蛋白变性:加入适量上样缓冲液金属浴100℃15min使蛋白变性;蛋白储存短期内使用蛋白可置于-20℃储存，长期储存置于-80℃中文名称英文名称基础培养基AdvancedDMEM/F12谷氨酰胺GlutaMAX4■羟乙基哌嗪乙磺酸缓冲液HEPES青霉素/链霉素penicillin/streptomycinN-乙酰半胱氨酸N-acetylcysteine尼可酰胺Niacinamide无血清添加剂B27表皮生长因子EGF纤维母细胞生长因子10FGF10肝细胞生长因子HGFWnt-3a**Wnt-3a胃泌素IgastrinIWnt信号通路激活剂**R-Spondinl头蛋白**NogginTG印抑制剂A83-01ROCK抑制剂*Y-27632地塞米松（诱导细胞增值）^^Dexamethasone牛血清白蛋白BSAMDM2抑制剂/p53激活剂**Nutlin3a**肿瘤培养可选者不加或低浓度使用*分离培养前三天加。