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狒猴桃细菌性溃疡病监测规范1范围本标准规定了舜猴桃溃疡病的监测原理、监测准备、监测区域、监测时期、监测方法、可疑样本检测方法、监测结论和资料保存本标准适用于江苏地区狒猴桃细菌性溃疡病的疫情监测2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的凡是注日期的引用文件,仅所注日期的版本适用于本文件凡是不注日期的引用文件,其最新版本包括所有的修改单适用于本文件GB“23621—2009农业植物检疫实验室基础条件LY/T1681—2006林业有害生物发生及成灾标准3监测原理丁香假单胞菌彳弥猴桃致病变种Pseudomonassyringaepv.actinidiaePsa属于薄壁菌门Gracilicutes变形菌纲Proteobacteria假单胞菌科Pseudomonadaceae假单胞菌属Pseudomonas是引发舜猴桃细菌性溃疡病的致病细菌设置监测区域,通过踏查和调查,依据狒猴桃细菌性溃疡病田间症状参见附录A、可疑样本病原菌检测及病原细菌生物学特征、致病性和分子生物学检测鉴定结果进行病害监测4监测准备收集当地骄猴桃属植物种植情况、狒猴桃细菌性溃疡病发生历史和现状等相关资料,制定有效易行的狮猴桃细菌性溃疡病监测计划5监测区域一般要求监测区域包含狮猴桃栽培种植果园、林场、种质资源圃、种苗繁育基地、砧穗繁殖圃、境外引进狒猴桃种苗种植区等,重点监测红阳、金艳、楚红、Hort16A.西选2号等易感病舜猴桃品种的集中种植区域未发生区重点监测疫情高风险区域,包括毗邻发生区的区域、有才弥猴桃细菌性溃疡病发生历史的果园、新建果园;狮猴桃产品集散地周围狮猴桃种植区,通往疫情发生区域交通要道沿线狮猴桃属、种植物等发生区重点监测发生物猴桃细菌性溃疡病的种植区及周边区域附录D资料性附录娜猴桃细菌性溃疡病菌Psa分离纯化步骤D.1病原菌分离纯化步骤无菌条件下用手术刀取病健交界处组织2mm〜3mmx2mm〜3mm分别用70%乙醇和
0.5%〜
1.0%的次氯酸钠表面消毒3min〜5min再用无菌水冲洗3次后,放在灭菌研钵中,用解剖刀充分切碎,力口1ml无菌蒸储水研磨成浆状静置lOmin用灭菌接种环蘸取以上组织液,在培养基平板上划线培养;先在平板的一侧顺序划3条〜5条线,再将培养皿转60,将接种环灭菌后,从第二条线末端划出3条〜5条线将培养皿倒置于25℃恒温培养48h〜72h筛选疑似单菌落进行划线纯化,25℃恒温培养48h后,观察菌落形态和病原菌形态特征D.2培养基配方
2.1牛肉膏蛋白陈培养基BPA:牛肉浸膏
3.0g蛋白陈
5.0g酵母粉L0g蔗糖
10.0g琼脂粉
15.0g蒸馆水补充至1000mL将上述药品溶于蒸储水,并调pH值到
6.8〜
7.0灭菌121℃15minD.
2.2金氏B培养基KBA蛋白陈
20.0g甘油
10.0g磷酸氢二钾K2HPO
41.5g硫酸镁MgSO4・7H2O
1.5g琼脂粉
15.0g蒸储水补充至1000mL将上述药品溶于蒸储水,并调pH值到
6.8〜
7.0灭菌121℃15min附录E资料性附录狮猴桃细菌性溃疡病菌Psa的PCR检测方法E.1试剂及配制PCR试齐I」特异弓I物对、dNTP25mmol/l、PCR缓冲液10x、氯化镁25mmol/l、TaqDNA聚合酶5U/gl2000bpDNAMarker5mol/lNaCL蛋白酶K20mg/ml、RNaseAlOmg/ml、无水乙醇、70%乙醇、核酸染料电泳缓冲液TBE5xpH
8.0每升溶液中含54gTris
27.5g硼酸,10mMEDTAo电泳时稀释成lx浓度使用琼脂糖凝胶1%称取
0.1g琼脂糖加入到10mlIxTBE溶液中,微波炉煮沸后加入1%体积核酸染料,混匀后制胶E.2细菌DNA提取用接种环挑取1〜2个943中纯化菌苔加入150|11无菌水中,混匀,100°煮沸lOmin12000rpm/min离心lOmin取上清作为待测模板亦可按常规方法或试剂盒提取细菌DNA后作为模板4c保存备用E.3PCR检测
3.1PCR检测引物使用基于16SrDNA和16S-23SrDNA间隔区序列ITS开发的狮猴桃溃疡病鉴定引物27F/1492R、PsaFl/PsaR2引物类型见下表表E.1引物类型
3.2PCR反应体系及扩增条件PCR反应体系为25HL体系细菌DNA模板10岬01/1正反引物各
0.
711、2mmol/ldNTPs
0.5|iklOxPCRBuffer
1.5|iL25mmol/lMgCh
1.5ikTaqDNA聚合酶
0.2囚、灭菌水
18.7比PCR扩增条件95℃预变性3min95℃变性30s55℃退火30s72℃延伸Imin30个循环;72℃5min16℃保持E.4凝胶电泳取出PCR样品,吸取8|ilPCR产物加入到1%琼脂糖凝胶点样孔中,同时用2000bpDNAMarker作为片段大小的标准,置于IxTBE电泳缓冲液中进行电泳20min〜30minE.5成像观察与记录电泳结束后,取出琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪下,根据DNAMarker片段判断扩增出的目的条带的大小,记录观察结果,并将电子文件存档备查E.6结果判定在阴性对照无扩增条带,阳性对照在280bp和1500bp处出现特异性条带的前提下,待测样品出现与阳性对照相同大小的特异性条带,样品判定为阳性,即携带有狮猴桃细菌性溃疡病菌;待测样品未出现与阳性对照相同大小的特异性条带,样品判定为阴性,即未携带有狮猴桃细菌性溃疡病菌6监测时期在每年3〜4月春芽膨大期和9〜10月初秋溃疡病发病小高峰时期分别进行1次监测;11月下旬至来年1月期间遭遇大风、暴雨、极速降温等异常天气应及时增加1次监测7监测方法访问调查向果农、相关生产经营者、农技人员等询问调查当地舜猴桃种植和狮猴桃细菌性溃疡病发生的情况特别是苗木、接穗和花粉来源和有无掰猴桃细菌性溃疡病疑似症状等情况,将调查记录填入附录B中表B.lo踏查对访问调查过程中发现的疫情发生区、可疑发生区和高风险区域进行重点踏查,踏查面积不小于被查面积的50%以自然界线、道路等为单位进行线路(目测)踏查,重点检查枝蔓及其分杈处、茎蔓幼芽、皮孔、落叶痕和新生叶片等(参见附录A第A.4节)踏查发现可疑症状应直接采样进行室内检测确认有疫情需进一步掌握危害情况的,应设样方做详细调查3样方调查
3.1种苗接穗繁育基地样方设置与调查样方的累积面积应不少于调查总面积的5%每块样方面积为
0.1hm2采取棋盘式取样法,抽取样树5株〜10株,进行病害分级调查(参见附录C)
3.2果园样方设置与调查按果园面积设置,10hm2以下(含10hm2)设1块样方,每增加5hm2增设1块样方每块样方面积为
0.1hm2采取棋盘式取样法,抽取样树10株,进行病害分级调查(参见附录C)将调查数据填入附录B中表B.28可疑样本检测方法
8.1采集部位所采集的样品应包含植物的感病叶片、花蕾、嫩梢、枝条等部分,应尽可能采集病株感病初期的部位,以利于病原细菌的分离2样品保存样品置于聚乙烯袋内或其他合适容器内防止污染样品应冷藏存放,避免受到阳光的照射[2:3实验室要求狒猴桃细菌性溃疡病菌鉴定用实验室的设置与管理符合GB/T23621—2009中农业植物检疫实验室基础条件要求
8.4常规检测
8.
4.1溢菌检查]用手术刀取一小块病健交界处组织,放于载玻片上,向病变组织上滴1〜2滴无菌水或蒸储水,加盖玻片后在低倍显微镜下(10X)观察,检查在水滴与组织交界处是否有云雾状菌溢
4.2革兰氏染色检测检查到菌溢的载玻片将植物组织移去,水滴干燥后通过火焰固定,采用结晶紫草酸胺染色法染色观察染色反应
4.3形态特征检测病原菌分离纯化、保存过程参见附录D舜猴桃细菌性溃疡病菌落和病原菌形态特征参见附录A第A.6章,根据菌落特征选取可疑菌落做进一步致病性测定和分子生物学检验
4.4致病性的测定
4.
4.1烟草过敏性反应将843纯化的狼猴桃溃疡病病原菌菌株划线培养后,取生长旺盛的菌株用平板计数法配成3xlO8CFU/mL的菌悬液,采用表皮皮下注射法注射2似菌悬液在六叶龄烟草叶片的细胞间,以注射2|J蒸储水为对照,3次重复,置于25c培养,12h后观察烟草叶片过敏性反应
4.
4.2常规接种测定对烟草叶片呈过敏反应的菌株,取浓度为3xlO8cFU/ml的菌悬液2111对红阳掰猴桃健康叶片和枝条进行离体针刺涂抹法接种,以蒸镭水接种为对照,3次重复,置于20℃恒温保湿环境,5d后逐日观察其发病情况,至20d5分子生物学检验用已知的骄猴桃溃疡病菌菌株作为阳性对照,非狒猴桃溃疡病菌的植物病原细菌作为阴性对照,无菌水作为空白对照进行PCR检测待测菌株DNA提取和PCR检测方法参见附录E如采用市售的试剂盒按说明操作6结果判定
6.1症状识别判定田间植株发病症状符合附录A描述物猴桃细菌性溃疡病典型症状,判定为物猴桃细菌性溃疡病
6.2常规诊断判定镜检有溢菌现象,革兰氏染色菌体呈红色,即呈现阴性反应,分离培养物在选择培养基上的菌落特征和培养特性符合附录A第A.5章描述,致病性测定产生典型症状,并再次从接种病斑成功分离病原菌,确定病原菌为舜猴桃细菌性溃疡病菌
6.3分子生物学检验结果判定观察PCR检测电泳结果,如扩增产物的片断大小与附录E第E.6描章描述相符,可以判定样品携带物猴桃细菌性溃疡病病菌,否则为阴性反应,即样品不携带狮猴桃细菌性溃疡病病菌
8.7检验记录检验记录应包括样品来源、种类(品种)、时间,检测的时间、地点、方法和结果,PCR检测需要有电泳结果照片等,并要有检测人员、审核人员签字上述材料应归档并妥善保存9监测结论整理汇总狮猴桃细菌性溃疡病监测调查记录,包括掰猴桃细菌性溃疡病的发生面积、发生范围、危害程度和变化趋势,病原鉴定过程中的各类信息(包括照片、影像等)等详细资料「并根据LY/T1681—2006林业有害生物发生及成灾标准评估疫情状况,形成监测报告,按国家、省林业主管部门规定上报10资料保存监测过程中的各类信息(包括照片、影像等)等详细资料应建立专门监测档案,妥善保存以备查附录A(资料性附录)狒猴桃细菌性溃疡病菌(Psa)相关资料A.1英文名称KiwifruitbacterialcankerA.2学名Pseudomonassyringaepv.actinidiaeA.3发病规律溃疡病菌主要在枝蔓病组织内越冬,春季从病部伴菌脓溢出,通过风、雨、昆虫和农事作业、工具传播,从伤口或自然孔口侵染寄主经过一段潜伏繁育期,逐渐导致发病新菌斑溢出菌脓后,经传播进行再侵染为害该病菌属于低温高湿性侵染病菌,一年有两个发病高峰时期,第一个高峰时期是狒猴桃萌芽前10天至落花期春季旬均气温10℃〜14℃时•(江苏省一般为3月上旬)开始发病,以主干、枝蔓发病为主,叶片发病很少随温度升高,主干和枝蔓逐渐停止发病,叶片、花蕾和花瓣上开始发病如遇高温阴雨天气,病害容易流行入夏气温升高,病害停止流行第二个发病时期是秋季果实成熟期前后一般在9月中旬开始发病,主要危害秋梢叶片,主干、枝蔓很少发病受害植株发病,上部枝条枯死后,又可萌发新枝,翌年感病后再次死亡,循环2〜3年后,整株死亡A.4症状诊断主要危害枝蔓、枝条,也可为害叶片和果实,以枝蔓受害最重A.
4.1枝溃疡症状枝蔓受害,多从萌芽初期开始发病,初期呈水渍状,后扩大,颜色加深,皮层组织隆起变软,有淡黄色或黄褐色病斑后期病斑处皮层纵向线状开裂,伤口、皮孔、芽眼、叶痕等部位流出滴状黄白色菌脓,干后在菌斑表面形成红褐色点状脓胶,剥开皮层后可见木质部呈黑褐色,韧皮部腐烂小枝条受害,多从芽周围发生,初期产生暗绿色或暗褐色水渍状,后很快扩展为暗褐色腐烂病斑,稍凹陷,易造成新梢枝叶萎藏枯死A.
4.2叶斑症状主要危害新生叶片,感病初期叶面呈现红褐色小点,后扩展为2mm〜3mm深褐色不规则或多角形病斑,病斑周围有2mm〜5mm的明显黄色水渍状晕圈病叶向里或向外翻卷,易脱落A.
4.3花果腐症状花蕾受害后不能张开,变褐死后脱落;果实受害,造成果实软腐,伤口处有褐色汁液流出A.5病原菌形态特征及培养性状物猴桃溃疡病菌为革兰阴性细菌,好氧菌体短杆状,两端钝圆,单细胞,菌体大小为(
1.4~
2.3)|imx(
0.3〜
0.5)Rm鞭毛极生,多为1根,少数为2〜3根,无荚膜,无芽苑I在牛肉蛋白豚培养基(BPA)平板上培养,菌落直径1mm〜3mm乳白色、圆形、凸起、边缘整齐,有光泽在金氏B培养基(KBA)平板上培养形成白色或浅黄色、表面光滑、有黄绿色荧光的菌落病原菌生长最适温度为25℃〜28℃生长最高温度为35℃生长最低温度为-12℃以下,致死温度为55℃10minoA.6传播途径在田间,该病原菌主要通过雨水、灌溉水、农具、昆虫等传播,由伤口、自然孔口侵入寄主组织可随种苗、接穗、砧木、花粉和昆虫等病菌携带者远距离传播附录B(规范性附录)猫猴桃细菌性溃疡病调查记录表表B.1殊猴桃细菌性溃疡病访问调查记录表表B.2殊猴桃细菌性溃疡病监测调查记录表调查单位调查时间年月日调查人(签字)附录c(资料性附录)猫猴桃细菌性溃疡病病害分级表引物类型上下引物产物大小引物序列5VT27F上引物AGAGTTTGATCCTGGCTCAG27F/1492R1492R下引物1500bpTACGGTTACCTTGTTACGATTPsaFl上引物TTTTGCTTTGCACACCCGATTTTPsaFl/PsaR2PsaR2下引物280bpCACGCACCCTTCAATCAGGATG调查单位调查人调查地点市县乡(镇)村(组)调查日期年月口经度/纬度坡度/坡向土壤质地、湿度与土壤厚度(cm)当地温度和降雨(特别记录休眠期11-1月以及萌芽期3-4月的情形)业主姓名联系方式品种平均树龄(年)种植面积(hm2)调查面积(hm2)种苗来源接穗来源花粉来源灌溉和排水情形施肥情形栽培方法(指出特点)症状描述感病各级株数I IIIII IVV VI果园感病等级备注检测编号作物品种及类型(苗圃、果园)调查地点监测面积(hm2)调查株数感病等级株数监测(鉴定)结果单株感病分级级数症状描述I级主干无病斑,全株枝条、蔓、口十无病II级主干无病斑,1~20片叶片或1/3枝条发病in级主干无病斑,21〜30片叶片或1/3〜1/2枝条发病w级病斑绕主干1/4〜1/2或31片以上叶片或1/2以上枝条发病V级病斑绕主干1/2〜3/4或植株部分枯死VI级病斑绕主干超过3/4或全株死亡果园感病分级(以感病株率计)无未发现感病株轻感病株率3%〜10%中感病株率11%〜20%重感病株率21%以上。