GST融合蛋白原核表达条件的优化及纯化分析

GST融合蛋白原核表达条件的优化及纯化分析引言蛋白的表达和纯化是蛋白质学研究中的关键步骤GSTGlutathioneS-Transferase融合蛋白是重要的表达蛋白质的工具之一GST融合蛋白分子量较小，表达容易，且可以通过GST结构域特异性地结合到硫酸亚铁柱上，便于纯化因此，GST系统已成为表达异源蛋白和获得大量纯化蛋白的常用方法本实验最初通过构建pGEX-6P-1质粒，利用GST标签结合GlutathioneSepharoseBeads进行富集，实现了目标蛋白的高效纯化然而，目标蛋白的融合表达量较低，为了提高表达效率和纯化效果，需要对表达条件进行优化，进行相关的实验探究材料与方法实验材料菌种大肠杆菌BL21DE3；质粒pGEX-6P-l表达目标蛋白；酶切酶EcoRIXhoI；亚硫酸氢钠、IPTG、L-谷氨酸、氨基茉青霉素、硫酸亚铁实验方法.制备重组质粒将目标基因重组到PGEX-6P-1载体上，转化至大肠杆菌中并筛选出完成基因插入的正常克隆取得正常克隆后，通过菌种测序确认克隆中的目标基因和本身的序列正确无误接着，用酶切酶EcoRI和XhI切割完成基因插入的正常克隆，并经过琼脂糖凝胶电泳纯化，获取目标质粒，并在-80℃保存备用.GST融合蛋白的原核表达选取半满菌草地比板中的单克隆洗菌，用含有

0.1mM卜谷氨酸和50ug/mL氨基茉青霉素培养至0D600=

0.6-

1.0范围内重悬得到的细胞在PBS中1LpH

7.4中孵育，然后加入1mMIPTG呈30℃孵育12小时孵育结束后，用冰盐水重悬得到的细胞，并在-80℃保存备用.特异性结合硫酸亚铁柱的GST融合目标蛋白的纯化检测细胞部位所表达的GST目标融合蛋白含量，分别进行超声裂解、螺旋向下离心，并用亚硫酸氢钠裂解细胞内部萃取物然后将上述物料用硫酸亚铁树脂柱纯化，洗涤希释与洗涤通过吸附的GST-目标蛋白络合物进行硫酸亚铁柱上的纯化，最终缓冲物为pH

7.0的PBSo结果与讨论.蛋白表达条件的优化本实验通过对表达温度、IPTG诱导浓度、IPTG诱导时间的调整和优化，提高目标蛋白的表达量结果表明，表达温度为30℃时，IPTG诱导浓度为

0.4初，IPTG诱导时间为12小时时，目标蛋白的表达量达到最高.GST融合蛋白的纯化本实验采用硫酸亚铁柱纯化的方法，最终可得到高纯度、单一的GST融合目标蛋白该柱能够特异性吸附GST结构域，并通过复杂的洗涤和洗脱步骤分离目标蛋白纯化后的蛋白可以进行鉴定和进一步的实验研究，具有重要的应用价值结论本实验对GST融合蛋白的原核表达和纯化方法进行了优化，通过对表达条件的探究提高了表达效率，通过硫酸亚铁柱纯化获得了高纯度的目标蛋白，为后续研究提供了重要的实验基础。